陆地棉E3泛素连接酶基因GhPUB 19D的克隆与功能分析

摘要

[目的]本文旨在克隆陆地棉U-box E3泛素连接酶基因GhPUB 19D并分析其在抵御生物和非生物胁迫中的功能及其作用机制。[方法]利用PCR从棉花cDNA文库中扩增盐胁迫和大丽轮枝菌处理均上调表达的GhPUB 19D全长cDNA;qRT-PCR分析GhPUB 19D的组织表达特征及其对不同非生物胁迫处理的响应;构建pBIN-GhPUB 19D-GFP载体并导入烟草叶片中,分析GhPUB19D的亚细胞定位;利用病毒介导的基因沉默(VIGS)和转基因过表达GhPUB 19D基因分析该基因对植物的耐盐性和抗病性的影响。[结果]GhPUB 19D基因ORF全长2043 bp,编码680个氨基酸,其编码的蛋白质含有1个U-Box和3个ARM结构域,定位于高尔基体。GhPUB 19D基因启动子区存在多种逆境胁迫响应顺式作用元件。GhPUB 19D在棉花根和叶片中优势表达。聚乙二醇(PEG)、NaCl、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)处理后,均可诱导GhPUB 19D在1 h达到表达峰值。VIGS沉默GhPUB 19D棉花在接种大丽轮枝菌Vd991之后,叶片黄化和枯萎较正常植物更为严重,植株发病率和病情指数均极显著增加。转GhPUB 19D基因可以提高拟南芥在ABA处理下的种子萌发率,但不能减轻ABA对幼苗生长的抑制作用;转GhPUB 19D基因可以提高拟南芥幼苗的耐盐性,ABA的SnRK2.3/2.6信号通路下游的AtABF 3和AtABF4对盐胁迫的响应增强,而AtRD26、AtMYB44、AtRAB18、SLAH3等对盐胁迫的响应减弱。转GhPUB19D基因可以显著减轻大丽轮枝菌病症,显著降低拟南芥植株中大丽轮枝菌含量,提高AtPR1、AtPR2、AtPR3、AtPR4、AtPR5、AtNPR1等系统获得抗性相关基因的表达及其对大丽轮枝菌的响应。[结论]过量表达GhPUB 19D可显著提高植物的耐盐性和黄萎病抗性。