乳酸克鲁维斯酵母（Kluyveromyces lactis）乳糖酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

摘要

β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶,β-D-galactoside galactohydrolase,EC3.2.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase),能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,并具有半乳糖苷的转移作用.乳糖酶主要用于改良乳制品和生产低聚半乳糖,还可用于蛋白质合成与遗传因子等方面的研究,具有重要的实践价值和理论意义.目前,工业生产中使用的乳糖酶主要来源于乳酸克鲁维斯酵母菌、黑曲霉和米曲霉.该论文从一株乳酸克鲁维斯酵母菌中克隆获得乳糖酶基因,在大肠杆菌中进行表达并测定其酶学性质,同时也对利用巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统表达该基因进行了探索.研究内容及结果如下:1.乳糖酶基因的克隆及原核表达以乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k538的基因组DNA为模板,设计引物,利用PCR获得乳糖酶基因Klac,经DNA测序验证,得到克隆T1549.乳糖酶基因插入到表达载体pET-30a(+)上构建重组表达质粒pETlac4,将pETlac4电击转化到大肠杆菌BL21中,分别研究了阳性转化子在28℃、37℃下经IPTG诱导3h后的蛋白表达情况.表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,Klac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0.475U/mL,37℃仅为0.134U/mL.2.原核表达乳糖酶的酶学性质测定制备原核表达乳糖酶的原酶液.以ONPG为底物,分别测定了其最适pH值及pH稳定性、最适温度及热稳定性、金属离子和化学试剂的影响以及Km值和Vmax值.该酶最适pH值为5.8和6.4~7.5,属中性酶,碱性条件稳定,酸性条件不稳定;最适反应温度45℃~52℃,热稳定性较差,不适于高温反应;Fe<'2+>、Mn<'2+>、Co<'2+>、Mg<'2+>和Zn<'2+>对乳糖酶有明显的激活作用,且该酶有一定的金属离子依赖性,Cu<'2+>具有很强的抑制作用;37℃、pH6.6条件下K<,m>=1.143mmol/L,V<,max>=142.857nmol/min.3.乳糖酶基因K/ac在巴斯德毕赤酵母中表达将Klac基因插入到载体pPIC9上构建重组表达质粒PIC9154983,电击转化巴斯德毕赤酵母受体菌GS115,经筛选和PCR鉴定,1＃、8＃和24＃为重组菌株,Klac基因整合到GS115基因组中.三个重组菌株经甲醇诱导培养未检测到分泌的乳糖酶,但胞内均检测到有活性的乳糖酶,分别为0.1392U/mL、0.3702U/mL和0.2214U/mL,说明乳糖酶基因Klac在巴斯德毕赤酵母中获得表达.

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1.1乳糖酶的高级结构和可能的作用机制

1.2不同来源的乳糖酶的酶学性质

1.3乳糖酶的应用

1.3.1解决乳糖不耐受症患者食用乳制品的问题

1.3.2改良乳制品

1.3.3生产低聚半乳糖

1.4真核表达系统

1.4.1啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统

1.4.2裂殖酵母(Saccharomyces pombe)表达系统

1.4.3甲醇营养型酵母表达系统

1.5基因工程技术在乳糖酶生产中的应用

第二章引言

第三章乳糖酶基因的克隆及原核表达

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1乳糖酶基因klac的PCR扩增与克隆

3.2.2含klac基因的原核重组表达质粒pETlac4的构建

3.2.3 klac基因在大肠杆菌中的表达

第四章原核表达乳糖酶的酶学性质测定

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果

4.2.1乳糖酶酶活性标准曲线的绘制

4.2.2乳糖酶的最适pH

4.2.3乳糖酶的最适温度

4.2.4乳糖酶的pH稳定性

4.2.5乳糖酶的热稳定性

4.2.6金属离子和相关化学试剂对乳糖酶活性的影响

4.2.7乳糖酶的Km和Vmax值

第五章乳糖酶基因在毕赤酵母中的表达

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果

5.2.1毕赤酵母重组表达质粒的构建

5.2.2筛选重组酵母菌株及乳糖酶基因的表达

第六章结论与讨论

6.1结论

6.2讨论

参考文献

缩略词表

致谢

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