原发性胆汁性肝硬化患者的临床特点及Th17细胞在发病中作用的研究

摘要

本研究分为二部分：
　　 第一部分：原发性胆汁性肝硬化患者进展到肝功能失代偿阶段的危险因素
　　 目的:分析我国未发生肝功能失代偿的原发性胆汁性肝硬化(primary biliarycirrhosis，PBC)患者的临床特点，并探索患者进展为肝功能失代偿的危险因素。
　　 对象与方法:通过对本课题组患者资料数据库的检索，该研究纳入了就诊于我院符合入选标准的PBC患者共262人。采集患者确诊/入组时的人口学信息和临床资料，分析他们的临床特点，并探索患者进展为肝功能失代偿的危险因素。
　　 结果:本研究共纳入262例PBC患者（女∶男≈14∶1，平均年龄=51.5±10.2岁），平均随访73.5月（21～201月）。245例(93.5％)患者血清抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibodies，AMAs)阳性。入组时，170例(64.9％)患者存在肝病相关症状，96例(36.7％)患者合并肝外自身免疫性疾病。在随访中，62例(23.7％)患者进展到肝功能失代偿阶段，其中4例患者接受了肝脏移植治疗，随访结束时，17例(6.5％)患者死于肝脏相关疾病，1例(0.4％)患者死于间质性肺病(interstitial lung disease，ILD)，1例(0.4％)患者死于淋巴瘤所致的多器官功能衰竭。患者5年和10年生存率分别为96.4％和83.9％。两组间均数比较显示，在基线时失代偿组患者年龄、症状出现率、抗核抗体(antinuclear antibodies，ANA)阳性率、血清抗着丝点抗体(anticentromere antibody，ACA)阳性率、门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、AST与丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)比值(alanineaminotransferase ratio，AAR)、谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）、总胆红素(total bilirubin，TBil)、间接胆红素(direct bilirubin，DBil)和IgA水平高于对照组;但熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)应答率、早期及极早期患者比例、白蛋白(albumin，ALB)水平低于对照组。Cox回归分析表明，不规律服用UDCA或对其应答不良(P＜0.001;HR95％ CI=2.423-7.541)、血清ACA阳性(P＜0.001;HR95％ CI=2.516-7.137)、AAR水平(P＜0.001;HR95％ CI=1.357-2.678)、TBil水平(P=0.004;HR95％ CI=1.002-1.009)和ALP水平升高(P=0.008;HR95％ CI=1.000-1.002)是患者发展为肝功能失代偿的危险因素。对病理分期单独进行Cox回归分析显示，其也是患者预后不良的危险因素(P=0.006;HR95％CI=1.481-10.847)。
　　 结论:
　　 1.我国PBC患者的临床特点和国外患者基本相同，但有症状的患者较多。
　　 2.初诊时，失代偿组患者年龄、症状出现率、ANA和ACA阳性率、AST、AAR、ALP、GGT、TBil、DBil和IgA水平高于未发生失代偿患者;但UDCA应答率、早期及极早期患者比例、ALB水平低。
　　 3.不规律服用UDCA或对其应答不良、血清ACA阳性、AAR水平、TBil水平、ALP水平及病理分期都是患者发展为肝功能失代偿的独立危险因素。
　　 第二部分：Th17细胞、IL-17在原发性胆汁性肝硬化发展中的作用
　　 目的:
　　 研究PBC患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)、肝脏中Th17细胞的水平。分析Th17细胞水平变化的原因，探索Th17细胞/白介素-17（Interleukin-17，IL-17）介导PBC肝纤维化发生的机制。
　　 对象与方法:
　　 1.提取PBC患者（35例）、健康对照（35例）和慢性乙型肝炎患者（15例）的PBMC，用流式细胞术分析Th17细胞占CD4+T细胞的水平;免疫组织化学染色比较PBC患者（16例）和健康对照者（4例）肝脏IL-17阳性细胞的水平。
　　 2.标记CD4、叉头样转录因子3(forkhead box3，Foxp3)、IL-17和干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）荧光标记抗体，分析PBC患者Th17细胞是否存在表型改变;流式细胞术分析调节性T细胞（regulatory T cells，Treg细胞）水平，并用磁珠分选患者（5例）和健康对照者（5例）的Treg细胞，体外培养鉴定其分类转化能力。
　　 3.流式细胞术分析PBC患者（20例）和健康对照者（20例）CD4+CD161+细胞占CD4+T细胞水平，并用流式细胞仪分选患者（5例）和健康对照组（5例）的CD4+CD161+细胞进行体外培养，CCK8法检测细胞增殖水平，酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测培养上清IL-17水平;ELISA检测血清IL-23水平。
　　 4.流式细胞术分析PBC患者（20例）和健康对照者（20例）CD4+CCR6+细胞占CD4+T细胞水平;ELISA检测血清CCL20水平;免疫组化分析肝脏CCL20水平。
　　 5.培养肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)，以0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL的重组人IL-17和10 ng/mL重组人IL-17+1μg/mL兔抗人IL-17进行干预，分别在24、72、144小时用CCK8法测定HSC增殖能力;利用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)检测α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin，SMA)在144小时的表达水平;利用ELISA检测培养上清IL-8在24、72、144小时的分泌水平。
　　 结果:
　　 1.PBC患者PBMC中Th17细胞水平高于慢性乙肝患者(1.03±0.22％比0.67±0.20％，P＜0.0001)，高于健康对照者（1.03±0.22％比0.55±0.20％，P＜0.0001）;免疫组化染色表明，PBC患者肝脏IL-17阳性细胞多于健康对照者。
　　 2.PBC患者外周血CD4+IL-17+ Foxp3+细胞(0.21±0.13％比0.06±0.04％，P＜0.0001)和CD4+IL-17+IFN-γ+细胞（0.39±0.16％和0.14±0.07％，P＜0.0001）占CD4+T细胞比例均高于健康对照者;CD4+IL-17+Foxp3+细胞和Th17细胞正相关(r2=0.441，P＜0.0001)，与Treg细胞无明显相关性;而CD4+IL-17+IFN-γ+细胞与Th17细胞、Th1细胞均无显著相关性;在IL-2、IL-6和TGF-β作用下，PBC患者减少的Treg细胞（2.37±1.24％比3.57±1.57％，P=0.0068）表达IL-17显著增加（4.46±0.60％至6.6±0.5％，P=0.0003），能力高于健康对照者(3.32±0.85％至4.18±1.29％，P=0.2491)。
　　 3.PBC患者CD4+CD161+细胞占CD4+T细胞比例较正常对照组高（22.24±5.33％比13.89±3.92％，P＜0.0001），但CD4+CD161+细胞和Th17细胞比例相关性无统计学意义(P=0.279);在IL-1β和IL-23的刺激下，患者和健康对照者CD4+CD161+细胞增殖率无统计学差异(1.079±0.093％比1.074±0.034％，P=0.9089)，但ELISA测定显示PBC患者培养上清IL-17浓度高于健康对照者(45.28±35.73 pg/mL比17.03±16.78 pg/mL，P=0.0556)。ELISA检测证实患者血清IL-23高于健康对照者（35.8±8.34 pg/mL比23.5±5.35 pg/mL，P=0.023）。
　　 4.晚期PBC患者外周血Th17细胞水平回落(0.93±0.16％比1.09±0.23％，P=0.0351)，但仍然高于健康对照者（0.93±0.16％比0.55±0.20％，P＜0.0001）;相反，与早期患者相比，晚期患者肝脏浸润的IL-17阳性细胞增多。PBC患者CD4+CCR6+细胞占CD4+T细胞与对照组相似(17.69±7.11％比17.62±6.71％，P=0.975)，且不受疾病分期影响（17.41±8.03％比18.11±5.98％，P=0.835），但患者血清趋化因子CCL20水平高于正常对照(53.23±38.58 pg/mL比23.54±21.95pg/mL，P=0.001)，且晚期高于早期（85.88±32.11 pg/mL比28.98±13.57 pg/mL;P=0.001）;免疫组化染色表明，患者肝细胞表达CCL20，健康者肝细胞几乎不表达CCL20，患者汇管区CCL20显著增加。
　　 5.随重组人IL-17浓度增加，HSC增殖率增加(P＜0.001);IL-17可以通过浓度和时间依赖性促进HSC表达IL-8（P＜0.001），但α-SMA表达量无明显改变(P=0.0847)。
　　 结论:
　　 1.与健康对照者和慢性乙型肝炎患者相比，PBC患者外周血Th17细胞升高，浸润在肝脏的IL-17阳性细胞增多。
　　 2.在IL-6、IL-2和TGF-β的刺激下，PBC患者Treg细胞发生分类转化，表达IL-17升高。上述机制可能是PBC患者外周血Treg细胞下降、CD4+IL-17+Foxp3+T细胞升高的原因。患者外周血CD4+IL-17+IFN-γ+T细胞也升高，但具体机制不详。
　　 3.PBC患者外周血Th17细胞前体细胞（CD4+CD161+T细胞）增多，在升高的炎症因子IL-1β和IL-23的活化下，表达大量IL-17。
　　 4.PBC患者升高的CCL20趋化外周血升高的Th17细胞向肝脏浸润，导致晚期患者外周血Th17细胞回落，肝脏IL-17阳性细胞升高。
　　 5.随IL-17浓度增加，HSC的增殖能力增强。IL-17还可以通过浓度、时间依赖性促进HSC分泌IL-8;IL-17拮抗剂可以抑制上述效应，有望延缓PBC患者肝纤维化的发生。

目录

英文缩略词

摘要

第一部分 原发性胆汁性肝硬化患者进展到肝功能失代偿阶段的危险因素

前言

研究背景

实验目的

对象与方法

结果

讨论

结论

第二部分 Th17细胞、IL-17在原发性胆汁性肝硬化发生发展中的作用

前言

研究背景

技术路线图

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

个人简历

致谢

声明