药物拯救HERG基因无义突变的机制及影响因素研究

摘要

第一部分:氨基糖苷类抗生素和PTC124对HERG无义突变体的拯救作用研究 背景： HERG（human ether-a-go-go-related gene）基因编码心脏快速激活延迟整流钾电流(IKr)通道的α亚基，在心脏复极化过程中具有重要作用。该基因突变可引起IKr通道电流异常，导致2型长QT综合征（LQT2）的发生，后者为一类遗传性心律失常，可导致反复发作的晕厥，严重者可导致猝死。大约10％的HERG基因突变为无义突变，即HERG基因中引入了提前发生的终止密码子(prematuretermination codons, PTCs)，导致蛋白的翻译提前终止，生成不完整的功能异常的通道蛋白。 在对囊性纤维化、Duchenne肌发育不良(DMD)等其他无义突变所致疾病的研究中发现氨基糖苷类抗生素可以通过提高囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)基因、DMD基因无义突变体的翻译通过率，产生全长有功能的蛋白，从而恢复突变体的结构和功能。我们先前的研究证实G418和庆大霉素在表达R1014X突变体（HERG突变体）的HEK293细胞中可以部分恢复HERG样电流，但是氨基糖苷类抗生素对HERG通道的恢复是否与药物种类及剂量相关尚不明确。 PTC124(3-[5-(2-fluorophenyl)-[1,2,4]oxadiazol-3-yl]-benzoic acid;C15H9FN2O3)是一种新合成的的小分子化合物，实验证实它也可以抑制PTCs，使蛋白翻译继续，生成完整的有功能的蛋白质，因此被认为是治疗无义突变所致基因疾病的一种新选择。该化合物在囊性纤维化、DMD等无义突变疾病模型中已得到验证，但是其在HERG通道无义突变中的作用未见报道。 氨基酸序列分析表明HERG通道由4个亚单位组成，每个亚单位包含细胞内的N端和C端、6个螺旋跨膜区(S1-S6)和1个孔区。现已知约30种无义突变分布在不同的区域。该基因不同部位的无义突变体对药物拯救后的反应目前还不清楚。 目的： 本研究拟通过制备不同的HERG无义突变体(E698X、W927X、R1014X等)，并使用不同浓度的四种药物(氨基糖苷类抗生素G418、庆大霉素、妥布霉素及非氨基糖苷类药物PTC124)作用于转染有不同的突变体的HEK293细胞，应用分子生物学方法及全细胞膜片钳技术检测给药前后HERG通道蛋白表达和功能的变化，探讨不同药物及其浓度对HERG通道无义突变体的作用，阐明突变部位对于药物拯救作用的影响。 方法： (1)采用定点突变的方法以野生型质粒为模板制备不同的无义突变体。(2)培养HEK293细胞，采用脂质体瞬时转染的方法将不同的突变体转染入HEK293细胞中表达。(3)Real-time PCR检测各组HERG mRNA的表达水平。(4)Western-blot检测各组给药前后HERG蛋白的表达。(5)全细胞膜片钳技术记录给药前后Ikr通道电流，研究相应通道的电生理特性以评价药物拯救后HERG通道的功能性表达。(6)免疫荧光观察给药前后突变体HERG蛋白的表达。(7)蛋白质谱分析纯化蛋白成分。 结果： 与野生型相比，无义突变的HERG通道蛋白的蛋白条带变短，mRNA水平无明显差异。突变位置靠近N端，蛋白表达量变少。庆大霉素、G418和PTC124均能部分恢复W927X、R1014X无义突变体完整蛋白的表达，并呈剂量依赖性变化，PTC124的作用弱于庆大霉素和G418，而妥布霉素无拯救作用。G418和庆大霉素干预后，R1014X突变体HERG通道蛋白的功能得到不同程度的恢复，其最大电流密度较给药前增加，通道的半激活电压也得到恢复。PTC124也增加了通道的电流密度，但不改变通道激活动力学。药物对不同无义突变体的拯救作用不同，靠近氨基端的无义突变无法被拯救。蛋白质谱分析发现转染目的突变体的细胞给药后有HERG蛋白的表达，由于细胞内存在多种混杂蛋白，目前尚无法分析在药物拯救过程中无义突变所产生的终止密码被何种氨基酸取代。 结论： 本研究证明了氨基糖苷类抗生素拯救无义突变的HERG通道具有药物选择性和剂量依赖性，并进一步证实非氨基糖苷类抗生素PTC124对HERG通道无义突变也有拯救作用。无义突变在DNA中的位置影响药物的拯救效率。这为将来进一步临床试验奠定了良好基础，为药物治疗无义突变所致的心律失常带来了新的希望。 第二部分:不同终止密码子及其下游序列对药物拯救HERG基因无义突变的影响 背景： 氨基糖苷类抗生素在多种无义突变导致的疾病模型中被报道可以通过抑制提前出现的无义密码子(PTCs)恢复全长有功能的蛋白表达。Howard等于1996在无义突变引起的囊性纤维化模型中首次发现了这种现象。他们观察到，G418可以抑制PTCs从而使得囊性纤维化跨膜转导调节蛋白(CFTR)基因表达全长蛋白。我们前面的实验结果表明，氨基糖苷类抗生素G418和庆大霉素均可以恢复HERG基因无义突变体R014X的蛋白及功能表达，并且拯救作用与药物剂量相关。 研究报道提前出现的终止密码子种类及其上下游的核苷酸序列可影响药物拯救无义突变的效率。携带有UGA无义突变的DMD患者给予庆大霉素后更容易使肌管的水平上调，其次是携带UAG或UAA无义突变的患者。在p53及APC基因无义突变抑制的研究中也观察到G418、庆大霉素使氨基酰-tRNA更容易通过含有UGA的无义突变位点。终止密码下游的第一位核苷酸（+4位）也可以影响抑制无义突变的效率，抑制效率依次为C＞U＞A＞G。此外，位于终止密码远端的核酸序列对于抑制效率也有一定的影响，但作用不如+4位核苷酸。在HERG基因无义突变的研究中， PTCs及上下游核苷酸序列的影响尚不明确。 目的： 本研究拟通过制备含有不同终止密码子和下游核苷酸序列的HERG-R1014X及HERG-W927X无义突变体(质粒终止密码子TGA、TAA、TAG对应于mRNA上的终止密码子UGA、UAA、UAG)，并使用氨基糖苷类抗生素G418作用于转染有不同的突变体的HEK293细胞，应用分子生物学方法及全细胞膜片钳技术检测给药前后HERG通道蛋白表达和功能的变化，阐明核苷酸序列对于药物拯救作用的影响。 方法： (1)采用定点突变的方法以野生型质粒为模板制备不同的无义突变体。(2)培养HEK293细胞，采用脂质体瞬时转染的方法将不同的突变体转染入HEK293细胞中表达。(3)全细胞膜片钳技术记录通道电流，研究相应通道的电生理特性以评价HERG通道的功能性表达。(4)免疫荧光观察给药前后突变体HERG蛋白的表达。 结果： 首先通过定点突变的方法制备了含有不同终止密码子的R1014X、W927X无义突变体并进行了测序验证。用免疫荧光的方法检测给药前后HERG蛋白的表达。将不同的突变体转染入HEK293细胞中，使用N端的抗体可以检测到转染不同突变体的HEK293细胞中均可以看到红色荧光，给药后使用C端抗体检测，各突变体均能检测到红色荧光。膜片钳记录结果提示R1014X-TGA、R10114X-TAA突变体被拯救后IKr尾电流密度增加，R1014X-TAG突变体药物作用后IKr尾电流密度没有明显变化。W927X-TGA、W927X-TAA、W927X-TAG突变体被拯救后电流密度也均增加，但W927X-TAG被拯救的效率弱于W927X-TGA、W927X-TAA。随后，我们在R1014X-TGAT的基础上又构建了R1014X-TGAC、R1014X-TGAG和R1014X-TGAA突变体，转染后免疫荧光检测观察到给药前后分别使用N端抗体和C端抗体均可以观察到红色荧光的表达。但是膜片钳方法仅在R1014X-TGAT突变体上记录到药物作用后IKr尾电流密度的增加，其他几种突变体与给药前相比IKr尾电流密度无明显变化。 结论： 终止密码子的种类及其下游的核苷酸序列可以影响氨基糖苷类抗生素对HERG基因无义突变体的拯救效率和功能表达。 第三部分:钙通道自身抗体预测慢性心力衰竭患者死亡风险的研究 背景 最近的研究表明，自身免疫机理在CHF的发病中起到重要作用，例如，在CHF病人的血清中发现β1-肾上腺素受体的自身抗体（作为受体激动剂），去除该抗体可改善CHF患者的血流动力学参数。扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)患者中Na-K-ATP酶的自身抗体具有致心律失常作用，可导致猝死的发生。兔的心肌细胞膜Na-K-ATP酶自身免疫化可导致钙超载所致心肌肥厚及心肌纤维化。因此，研究影响心肌的自身抗体可能有助于理解CHF的发病机理。 L-钙通道在心肌兴奋-收缩脱耦联中起到关键作用，该通道功能障碍可导致室性心律失常的发生。目前的研究证实钙通道自身抗体(calcium channelautoantibodies，CC-AAbs)与DCM的发病明显相关，Xiao等在DCM动物模型中检测到CC-AAbs的存在，并发现CC-AAbs可延长动作电位时程从而导致室性心律失常的发生。 目的： 本研究旨在检测DCM和ICM所致CHF中CC-AAbs的表达，并分析CC-AAbs的表达与DCM和ICM导致的心衰病人预后是否具有相关性。 方法： 共入选2096例CHF患者（包括841例DCM患者和1255例ICM患者）及834例对照组受试者，酶联免疫法检测CC-AAbs的表达水平，应用Kaplan-Meier曲线及Cox回归检验进行组间比较，并分析CC-AAbs表达与DCM和ICM病人预后的相关性，确定CC-AAbs是否为DCM和ICM患者猝死(SCD)、非猝死性死亡(NSCD)和全因死亡的独立预测因子。 结果： 完成随访1831例（失访率12.6％），其中DCM患者死亡248例（猝死102例）;ICM患者死亡330例（猝死121例），随访中位数为52月（0.40～92月）。CHF患者中CC-AAbs的阳性表达明显高于正常对照(5.87％，4.64％ vs.1.20％，P＜0.001)。Cox回归分析表明阳性CC-AAbs与CHF患者的死亡呈明显正相关，CC-AAbs阳性可以预测CHF患者的猝死（HR3.191，95％ CI1.598-6.369 forDCM, HR2.805，95％ CI1.488-5.288 for ICM）及全因死亡(HR1.733，95％ CI1.042-2.883 for DCM; HR2.219，95％ CI1.461-3.371 for ICM)。在ICM导致的CHF患者中，CC-AAbs与NSCD也有明显的相关性(HR=1.887，95％ CI1.081-3.293)。 结论： DCM和ICM导致的CHF患者中CC-AAbs的水平明显增加，并且CC-AAbs的表达与CHF患者的SCD及全因死亡具有明显相关性，是CHF患者SCD和全因死亡的独立预测因子。

目录

缩略语表

第一部分：氨基糖苷类抗生素和PTC124对HERG无义突变体的拯救作用研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分：不同终止密码子及其下游序列对药物拯救HERG基因无背景义突变的影响

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分：钙通道自身抗体预测慢性心力衰竭患者死亡风险的研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 氨基糖苷类抗生素治疗无义突变致遗传性疾病的研究进展

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