第一部分：两个三指节拇指-轴前多指家系的ZRS突变分析；第二部分：家族性甲状腺非髓样癌遗传基础的初步研究

摘要

本文分为以下两个部分进行探讨：
　　第一部分:两个三指节拇指-轴前多指家系的ZRS突变分析
　　在人类先天肢端畸形中，多指畸形是相对常见的畸形。按多指的发生部位，大致分为轴前多指、轴后多指、中央多指。发生于桡侧的多指畸形被称为轴前多指(preaxial polydactyly，PPD)。PPD可独立发生，如PPDⅠ-Ⅳ型;也可作为某些综合征的部分表型，伴随其它表型出现。三指节拇指(triphalangeal thumb，TPT)可与PPD并发，例如PPDⅡ、PPDⅢ均具有TPT特征，二者在临床上难以严格区分，我们统称为三指节拇指-轴前多指。
　　极化活性区调控序列(zone of polarizing activity regulatory sequence，ZRS)位于LMBR1基因第五内含子内，长度约1.3kb。其作为增强子远程调控距其1Mb左右的SHH基因(sonic hedgehog)在胚胎肢芽后缘表达，形成极化活性区(zone of polarizingactivity, ZPA)。当ZRS发生突变以致产生额外的转录因子结合位点，导致SHH在胚胎肢芽前缘异位表达并形成异位的ZPA，则可造成以TPT和PPD为典型特征的多种表型。如三指节拇指-多并指综合征(triphalangeal thumb-polysyndactyly syndrome,TPT-PS)，TPT1，PPDⅡ，胫骨发育不全伴多指（趾）(tibial hypoplasia or aplasia with polydactyly,THYP)，Laurin Sandrow综合征(Laurin Sandrow syndrome, LSS)等。
　　目的:分析两个具有三指节拇指/轴前多指特征的中国汉族家系的致病突变。
　　方法:1）在所有患者及相关亲属知情同意的情况下，采集家系1的9名家庭成员（患者2例）、家系2的14名家庭成员（患者7例）的外周血，提取基因组DNA。2）采用实时定量PCR(qPCR)与PCR-Sanger测序，针对ZRS分别进行拷贝数变异检测和序列突变检测。3）使用200名无关正常人基因组DNA作为对照进行验证。4）使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测家系1ZRS附近作为遗传标记的短串联重复序列重复次数，结合Sanger测序发现的点突变及SNP进行单倍型分析。
　　结果:1）qPCR结果显示，两家系患者均无ZRS拷贝数变异。2）Sanger测序结果显示，家系1的两患者均存在ZRS406A＞G杂合突变，家系2的7例患者均存在ZRS10SC＞G杂合突变，且突变在各自家系中均与多指表型共分离。3）在200名正常对照中均未发现上述突变。4）单倍型分析及测序结果提示，家系1中第一例出现肢端畸形的患者为ZRS406A＞G突变的体细胞及生殖细胞嵌合体。
　　结论:5HH基因调控序列ZRS的406A＞G，105C＞G杂合突变分别为两个中国汉族三指节拇指轴前多指家系的致病突变。
　　第二部分:家族性甲状腺非髓样癌遗传基础的初步研究
　　甲状腺癌(thyroid cancer, TC)是人类最常见的内分泌系统恶性病变，其发病率在中国乃至全球范围内均迅速上升。甲状腺癌根据不同的细胞起源可分为两大类:起源于滤泡细胞的甲状腺非髓样癌(nonmedullary thyroid cancer, NMTC)和起源于滤泡旁细胞的甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer, MTC)。全部甲状腺癌中的95％为NMTC，约有4.2％的NMTC家族中有2个以上患者，此种NMTC称为家族性甲状腺非髓样癌(familial nonmedullary thyroid cancer, FNMTC)。FNMTC的预后明显差于散发NMTC，需要进行更积极的临床治疗。目前通过家系连锁分析、全基因组关联分析和全外显子组测序等方法，仅有约10个候选致病基因/位点报道，其遗传学证据和致病机制均有待进一步明确。且大部分FNM TC病例尚未发现可能的遗传基础。
　　目的:通过对10个FNMTC家系（家系1-10）的遗传学分析，探究FNMTC的遗传机制。
　　方法:1）在所有家系患者及亲属知情同意的情况下，采集各家系部分成员的外周静脉血，提取基因组DNA。2）针对家系2中的三名患者和一名家系内正常人，通过单核苷酸多态微阵列(SNP array)检测其全基因组范围内的DNA拷贝数变异，并筛选其中与表型共分离的变异。3）针对家系2中的三名患者和一名家系内正常人，通过全外显子组测序(whole-exome sequencing，WES)，筛选位于外显子及外显子侧翼序列且与表型共分离的突变，并通过基因频率、序列保守性、突变位置等因素进行分析。经PCR-Sanger测序验证，确定家系2的候选基因。4）在其它9个FNMTC家系中各选择一名患者，通过PCR-Sanger测序检测其在家系2候选基因外显子及侧翼序列是否存在可能致病突变，并针对检测到的可能致病突变，对相应家系的全体成员进行突变位点测序，进行家系内共分离分析。5）对文献报道的FNMTC可能致病基因HABP2，在10例FNMTC家系中各选一名患者，对基因外显子及外显子侧翼的内含子序列进行PCR-Sanger测序，分析是否存在致病突变。
　　结果:1）对家系2的SNP array分析中未发现可疑的致病拷贝数变异。2）通过家系2的WES，筛选得到候选基因13个，分别为:ERBB3、GTF2F2、GALC、MPP4、CCDC150、SPRYD3、C14orf16、GSE1、MNAT1、TRIP12、FMNL3、DNAH、NCL。
　　3)在其它9个FNMTC家系的候选基因测序中发现，家系7被检患者携带TRIP12c.561C＞T杂合突变，家系8被检患者携带GSE c.3491-3495 del杂合突变。但两突变在家系7，家系8中均不与NMTC表型共分离。4）对HABP2基因测序，10个家系的被检患者均不携带致病突变。
　　结论:本研究通过高通量基因组变异检测方法，筛选出若干FNMTC候选致病基因，目前工作尚不能确定其遗传致病性，但为今后继续探索家系2的遗传机制奠定了工作基础。

目录

第一部分：两个三指节拇指．轴前多指家系的ZRS突变分析

摘要

1．前言

2．材料

3．方法

4．结果

5．讨论

6．小结

第二部分：家族性甲状腺非髓样癌遗传基础的初步研究

摘要

1．前言

2．材料

3．方法

4．结果

5．讨论

6．小结

参考文献

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