产ε-聚赖氨酸菌种的选育和发酵生产研究

摘要

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由白色链霉菌或北里孢菌通过发酵产生的由α-羧基和ε-氨基连接而成的L-赖氨酸均聚物，聚合度通常在25-35之间，因其多聚阳离子的性质而被广泛应用与食品，医药等领域，是目前较为常用的食品防腐剂之一。本课题主要从菌种诱变，发酵生产，分离纯化，抑菌性能几方面展开研究。
　　通过Gly诱变，AEC诱变，紫外诱变和硫酸二乙酯诱变，我们得到了一株高产菌Streptomyces sp.DES20，该菌株产ε-聚赖氨酸能力达到0.368 g/L，较原始菌株提高了87.76％，并且在7种适合放线菌生长的培养基上都能良好生长。响应面实验设计成功地找出了在发酵过程中影响ε-聚赖氨酸产量的因素，并得出其与葡萄糖(A)，硫酸铵(B)及酵母浸粉(C)之间的关系式，由此将M3G培养基进行改良，菌株Streptomyces sp.DES20在此培养基基础上进行发酵可使ε-聚赖氨酸积累量提高至0.410 g/L。Streptomyces sp.DES20的5L罐分批发酵产量为2.637 g/L，是摇瓶产量的6.279倍，在此基础上进行的补料分批发酵解决了分批发酵后期碳源匮乏问题，使ε-聚赖氨酸积累量提高至6.701 g/L，除此之外，向初始培养基中添加2g/L的柠檬酸钠可以同时提高生物量及ε-聚赖氨酸合成速率，发酵结束后，ε-聚赖氨酸的产量进一步提高至8.351 g/L。
　　ε-聚赖氨酸的分离纯化采用酸碱两种洗脱方式，二者都能将ε-聚赖氨酸有效的提取，酸洗脱的回收率为89.23％，样品纯度高达95.12％，而碱洗脱效果稍差，回收率和样品纯度分别为80.99％和81.68％。紫外光谱，红外光谱及核磁共振波谱综合证明发酵产物为ε-聚赖氨酸而非α-聚赖氨酸，MALDI-TOF-MS证明其聚合度在26-33之间。同时，抑菌实验表明分离样品对几株菌都有较好的抑制效果。

目录

声明

摘要

符号和缩略词说明

第一章 绪论

1．1 ε-聚赖氨酸简介

1．2 ε-聚赖氨酸的抑菌机制

1．3 ε-聚赖氨酸的生物合成机制

1．4 ε-聚赖氨酸生产菌株的选育

1．4．1 ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选

1．4．2 ε-聚赖氨酸生产菌株的诱变

1．5 ε-聚赖氨酸的工业化生产

1．5．1 两段控制法发酵

1．5．2 混合碳源发酵

1．5．3 优化培养基组成发酵

1．5．4 固定化细胞发酵

1．5．5 气升式反应器发酵

1．6 ε-聚赖氨酸的分离纯化

1．7 ε-聚赖氨酸的应用

1．7．1 ε-聚赖氨酸在食品工业中的应用

1．7．2 ε-聚赖氨酸在医药领域的应用

1．7．3 ε-聚赖氨酸的其他应用

1．8 选题的目的、意义及课题的研究内容

1．8．1 选题的目的、意义

1．8．2 课题的研究内容

第二章 ε-聚赖氨酸生产菌的选育与生理生化鉴定

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 材料与设备

2．2．2 培养基及培养条件

2．2．3 甘氨酸诱变

2．2．4 AEC诱变

2．2．5 紫外诱变

2．2．6 硫酸二乙酯(DES)诱变

2．2．7 ε-聚赖氨酸产量测定

2．2．8 明胶液化实验

2．2．9 牛奶胨化实验

2．2．10 淀粉水解实验

2．3 结果与讨论

2．3．1 ε-聚赖氨酸标准曲线绘制

2．3．2 甘氨酸诱变结果

2．3．3 AEC诱变结果

2．3．4 紫外诱变结果

2．3．5 硫酸二乙酯(DES)诱变结果

2．3．6 菌株在不同培养基上的生长情况

2．3．7 明胶液化、牛奶胨化、淀粉水解实验结果

2．4 本章小结

第三章 ε-聚赖氨酸的发酵生产

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 材料与设备

3．2．2 响应面优化培养基成分

3．2．3 分批发酵

3．2．4 补料分批发酵

3．2．5 添加柠檬酸钠补料分批发酵

3．3 结果与讨论

3．3．1 响应面优化培养基成分

3．3．2 分批发酵结果

3．3．3 补料分批发酵结果

3．3．4 添加柠檬酸钠补料分批发酵结果

3．3．5 三种发酵方法对比

3．4 本章小结

第四章 ε-聚赖氨酸的分离纯化与结构表征

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 材料与设备

4．2．2 发酵液预处理

4．2．3 树脂预处理

4．2．4 产物分离与纯化

4．2．5 产物纯度测定

4．2．6 紫外光谱测定

4．2．7 红外光谱测定

4．2．8 核磁共振波谱测定

4．2．9 产物聚合度测定

4．2．10 抑菌圈实验

4．2．11 MIC实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 酸洗脱方式分离ε-聚赖氨酸

4．3．2 碱洗脱方式分离ε-聚赖氨酸

4．3．3 分离样品纯度分析

4．3．4 分离样品结构表征

4．3．5 抑菌圈实验结果

4．3．6 MIC实验结果

4．4 本章小结

第五章 结论和展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

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