谷氨酰胺转氨酶在脂肪酶稳定性改善中的应用

摘要

脂肪酶是工业应用中最为广泛的酶制剂之一，可应用于食品、洗涤剂、制药、皮革、纺织、化妆品、造纸工业和生物柴油等领域。天然的脂肪酶稳定性一般较差，而工业应用上在生产、运输、存储工程中对于酶的活性和稳定性都有一定的要求。因此需要对酶进行改造修饰从而提高酶的活性和稳定性。
　　在近些年的研究中，脂肪酶改性的方法主要有蛋白质工程（包括定向进化和理性设计）、脂肪酶的固定化（吸附法、共价结合法、包埋法）。这些方法都能够一定程度上有效的改善脂肪酶的性能。但是蛋白质工程耗时长，操作繁琐，而固定化需要考虑载体的选择和成本问题，因此我们希望通过一种简单有效的方法对脂肪酶进行改性修饰来达到我们预期的目的。谷氨酰胺转氨酶(TGase)是食品蛋白加工中常用的一种交联剂。它可以催化蛋白质或多肽的谷氨酸(Glu)的γ-羧酰胺残基和赖氨酸(Lys)的ε-氨基发生酰基转移反应，生成异肽键（ε-（γ-谷氨酰胺）-赖氨酸），从而使蛋白质分子之间或之内发生共价交联。谷氨酰胺转氨酶在食品加工中可以有效的改善食品蛋白的稳定性、溶解性、保水性等性质。而酶分子也是一种蛋白质，因此本论文将谷氨酰胺转酶应用于脂肪酶的改性修饰过程。
　　与戊二醛等传统化学交联剂相比，TGase安全、无毒且生物相容性好。研究过程中对TGase催化制备交联酶的条件进行了优化，并对交联体系中的保护蛋白进行了筛选，最后得出最优的反应条件为TGase添加量为120U/g lip，反应体系pH7(离子强度100mM)，25℃，180rpm，反应24h，最适保护蛋白为明胶，添加量为脂肪酶∶明胶=2∶1。通过脂肪酶的热稳定实验，TGase催化制备的交联脂肪酶在50℃，1h条件下酶活基本没有损失，而游离脂肪酶在1h后，酶活保留率仅在20％左右，说明采用这种方式交联后可以有效改善酶的热稳定性。此外我们还选取了不同来源的脂肪酶（如lipase Mfrom Mucor Javanicus、lipase Gfrom Penicillium Camemberti、lipase Afrom Aspergillus niger、lipase from porcine pancreas等）利用此方法进行了改性修饰，证明了此方法具有一定的普适性。通过不伺的分析手段如电镜、荧光光谱、圆二色谱对交联脂肪酶进行了分析表征，通过电镜分析交联酶分子的尺寸变大，荧光光谱分析发现交联酶在400nm左右出现新的发射峰，圆二色谱分析交联酶的α-Helix解构有所减少。除了提高了脂肪酶的活性和稳定性，我们还发现脂肪酶的过氧化氢耐受性有了一定的提高，因此我们将交联脂肪酶应用于油酸的环氧化体系，转化率可达90％，而游离酶只能达到60％。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 脂肪酶

1．2 脂肪酶的稳定性改造

1．2．1 蛋白质工程

1．2．2 固定化脂肪酶

1．3 京尼平

1．3．1 京尼平简介

1．3．2 京尼平应用概况

1．4 谷氨酰胺转氨酶(TGase)

1．4．1 TGase简介

1．4．2 TGase应用现状

1．5 本论文的研究思路和内容

2．1 引言

2．2 实验材料和设备

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验设备

2．3 实验方法

2．3．1 交联剂的选择

2．3．2 交联酶制备条件的优化

2．3．3 保护蛋白的选择

2．3．4 交联脂肪酶热稳定测试

2．3．5 TGase催化制备交联酶在其他脂肪酶中的应用

2．4 实验结果及分析

2．5 本章小结

第三章 交联脂肪酶的表征和分析

3．1 引言

3．2 实验材料和设备

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验设备

3．3 实验结果

3．3．1 荧光分光光度计分析

3．3．2 圆二色谱分析

3．3．3 扫描电镜表征分析

3．3．4 激光共聚焦表征分析

3．4 本章小结

第四章 TGase催化制备交联酶在不饱和脂肪酸环氧化体系中的应用

4．1 引言

4．2 实验材料和设备

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验设备

4．3 实验方法

4．3．2 交联酶在油酸环氧化体系中的应用

4．4 实验结果和分析

4．4．1 过氧化氢耐受性

4．4．2 油酸环氧化

4．5 本章小结

第五章 结论与创新点

5．1 主要结论

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

致谢

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