基于DNA杂交技术的毛细管酶微反应器的研究

摘要

毛细管电泳法由于具有样品消耗量少、分析速度快、操作简便、容易分离和定量以及可以与多种检测手段联用等优点，已经发展成酶分析的重要工具之一，因此，制备一种具有高柱容量和可再生使用的毛细管酶微反应器一直是该领域研究的热点。本论文结合DNA分子杂交技术和树枝状分子的优势，将胰蛋白酶固定到氨基化的毛细管壁上，建立新型的毛细管酶微反应器。首先探索建立离线模式毛细管酶微反应器;在离线基础上，证明了基于DNA杂交技术在线毛细管酶微反应器的可行性。
　　(1)在硅烷化的石英毛细管壁上键合了聚酰胺胺树枝状大分子，在此基础上采用DNA杂交技术固定胰蛋白酶，制备出基于DNA杂交技术的离线模式毛细管酶微反应器。激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)表征结果证明了酶通过DNA杂交技术成功固定在功能化毛细管管壁。将制备的离线模式毛细管酶微反应器用于N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)的水解，以此评价酶微反应器的特性。通过DNA杂交和去杂交实验表明了该酶微反应器的可再生性。此外，与传统制备方式相比，树枝状大分子的引入提高了酶固载量，从而改善了酶解效率。在此基础上，将制备的毛细管酶微反应器成功应用于细胞色素C的消解，展现出较好的酶切效果，得到酶切肽端数为8，序列覆盖率为59％。这种可再生且高效的新型毛细管酶微反应器结合了DNA杂交技术和树枝状大分子的优点，并为后续建立基于DNA杂交技术在线模式毛细管酶微反应器提供基础。
　　(2)在离线模式的基础上，利用DNA杂交技术将胰蛋白酶固定在毛细管柱前端，建立在线模式毛细管酶微反应器。以BAEE为底物，优化在线毛细管酶微反应器酶解分离条件，实现在同一毛细管内连续完成酶催化反应、分离和检测分析全过程，缩短酶分析时间，提高自动化程度。结果表明制备的在线毛细管酶微反应器酶学性质稳定，性能良好，为以后开展在线目标蛋白质的酶解提供基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 毛细管电泳

1．1．1 毛细管电泳的概念

1．1．2 毛细管电泳的特点

1．1．3 毛细管电泳的应用

1．2 毛细管电泳在酶分析中的应用

1．2．1 离线毛细管电泳酶分析

1．2．2 在线毛细管电泳酶分析

1．3 DNA杂交技术

1．4 聚酰胺胺树枝状大分子

1．5 课题提出与研究内容

第二章 基于DNA杂交技术的离线模式可再生胰蛋白酶毛细管酶微反应器的制备及其在蛋白质消解中的应用

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 实验过程

2．3 结果与讨论

2．3．1 DNA-PAMAM功能化毛细管柱的表征

2．3．2 毛细管酶微反应器酶解条件的考察

2．3．3 基于DNA杂交技术的胰蛋白酶毛细管酶微反应器米氏常数的考察

2．3．4 不同氨基化方法对毛细管酶微反应器酶解效果的影响

2．3．5 DNA杂交技术对酶解效果的影响

2．3．6 毛细管酶微反应器稳定性考察

2．3．7 固定化酶可逆性考察

2．3．8 毛细管酶微反应器在蛋白质消解中的应用

2．4 小结

第三章 基于DNA杂交技术的在线模式可再生胰蛋白酶毛细管酶微反应器的探索

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 实验过程

3．3 结果与讨论

3．3．1 在线酶柱体系的验证

3．3．2 在线酶分析条件的优化

3．3．3 在线毛细管酶微反应器米氏常数的考察

3．3．4 在线毛细管酶微反应器稳定性考察

3．4 小结

第四章 结论

参考文献

研究成果及其发表的学术论文

致谢

作者及导师简介