呋喃它酮代谢物酶免疫分析方法的研究

摘要

兽药能促进畜禽生长、改善畜产品的肉质与口感、增加饲料利用率、减少动物的发病率、增加存活率，在现代畜牧业生产中有不可或缺的地位。但实际生产中，误用、滥用兽药，导致畜牧产品中兽药残留超标，经食物链进入人体后，易蓄积毒性、产生耐药性等、严重时威胁人体健康。呋喃它酮属于硝基呋喃类药物，半衰期只有几个小时，在体内会被迅速代谢为3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮（AMOZ）能够稳定存在，目前建立的检测呋喃它酮代谢物常用的方法是仪器分析法，这些检测法灵敏度高特异性强，但仪器昂贵、操作复杂、需要专业的人员进行操作并耗时不能够普及。本研究建立的检测AMOZ酶免疫吸附法（ELISA）、生物素-亲和素放大酶免疫分析法（BA-ELISA）与化学发光酶免疫法（CLEIA）是基于抗原抗体特异性反应的酶免疫分析法，与仪器分析法比较该方法操作简便、仪器简便、检测速度快、成本低，能够对样品进行批量的快速筛查。　　首先，将AMOZ与对醛基苯甲酸（4-CBA）衍生化反应合成CPAMOZ，用核磁共振与红外光谱对合成的物质鉴定。CPAMOZ与卵清蛋白（OVA）通过活化酯法偶联得到人工抗原CPAMOZ-OVA，并通过紫外扫谱进行鉴定。　　其次，对影响酶免疫法的主要因素优化。ELISA法最优工作浓度：包被原稀释倍数与单克隆抗体稀释倍数分别为500与2000，2％脱脂乳为封闭液，竞争时间与辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗（HRP-IgG）孵育时间都为30 min，显色15 min。CLEIA法化学发光液的最优工作浓度为：对碘苯酚溶液与鲁米诺溶液按浓度分别为6 mmol/L与10 mmol/L按等体积比混合为化学发光A液，4μL30%H2O2溶液滴入10 mL Tris-HCl中为B液；临用前将A液与B液等体积比混合使用。CLEIA最优工作浓度：包被原与单克隆抗体稀释倍数均为4000，2%脱脂乳作为封闭液，竞争反应与二抗孵育时间均为30 min。BA-ELISA法最优工作浓度：包被原与单克隆抗体稀释倍数分别为1000与2000，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（SA-HRP）稀释倍数为8000，封闭液为2%脱脂乳，竞争反应与SA-HRP孵育时间均为30 min，生物素标记羊抗鼠二抗(Biotin-IgG)孵育时间为60 min，显色时间为15 min。　　最后，3种酶免疫法在灵敏度、特异性、精密度和准确度4个方面进行方法评价。ELISA线性方程为y=-0.439x+0.670（R2=0.992），IC50为2.439 ng/mL，线性范围为0.506~11.765 ng/mL；批内变异系数（CV）和批间CV分别为1.4%~5.8%和2.1%~4.9%；回收率为86.7%~90.1%，CV为4.8%~7.3%。CLEIA线性方程为y=-0.493x+0.471（R2=0.995），IC50为0.873 ng/mL，线性范围为0.215~3.545 ng/mL；批内和批间CV分别为1.5%~4.3%和1.2%~5.2%；回收率为88.9%~94.2%， CV为4.2%~6.3%。BA-ELISA线性方程为y=-0.442x+0.483(R2=0.999)，IC50为0.915 ng/mL，线性范围为0.192~4.367 ng/mL；批内和批间 CV分别为1.3%~4.2%和1.1%~5.6%；回收率为92.5%~94.6%，CV为4.4%~9.6%。高效液相色谱法-串联质谱（HPLC-MS/MS）回收率为98.7%~99.8%，CV为1.1%~2.6%。建立的3种检测AMOZ酶免疫分析法与其代谢物以及衍生物均没有交叉反应，交叉反应率（CR）均小于0.1%。本研究建立的检测AMOZ代谢物的3种酶免疫分析法均能够满足实际检测的要求，可用于对AMOZ的快速筛查。

目录

第一章 绪论

1.1 兽药残留现状

1.2 硝基呋喃类药物概述

1.3 硝基呋喃类化合物仪器分析法

1.4 硝基呋喃类化合物免疫分析法

1.5 研究的意义和内容

第二章 呋喃它酮代谢物人工抗原的合成与鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 呋喃它酮代谢物酶免疫分析方法的建立及优化

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果分析

3.4 讨论

第四章 呋喃它酮代谢物酶免疫分析方法评价

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录 缩略语表

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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