利用诱导多能干细胞研究丙戊酸诱发Alpers-Huttenlocher综合征肝毒性的机理

摘要

丙戊酸钠(VPA)是目前在世界范围内使用最广泛的一线抗惊厥药物和定期用于偏头痛治疗、双相性精神障碍和慢性头痛的治疗药物，并且经常也会拿来作为辅助的化疗，但是VPA的使用会造成严重肝损伤的副作用。Alpers综合征(AHS)，是一种由于线粒体DNA聚合酶POLG基因突变造成的遗传性线粒体遗传性疾病。Alpers综合征最显著的一个肝病特征是对于在幼儿时期发生的VPA诱导的肝毒性具有很高的风险。然而，这种高风险的肝毒性发生的机制是什么一直还不清楚，因此本文试图利用体外分化建立的疾病模型来探索其中的原因。
　　在本研究中，我们将两例AHS病人的成纤维细胞诱导成为病人特异性的诱导多能性细胞，然后在用无血清体系下将它们的多能干细胞分化成病人来源特异性肝细胞（AHS iPSCs-Hep）。两个病人的分化的肝细胞与正常的对照细胞相比，都对VPA诱导的肝毒性非常敏感，产生凋亡。并且，细胞凋亡是依赖线粒体途径的，因为凋亡蛋白caspase-9和caspase-3都被激活，而且细胞色素c也被释放出来。与此同时，值得注意的是，AHS病人肝细胞中线粒体内保持线粒体嵴紧密和保护细胞色素c不被释放出来的OPA1复合物的量也比正常对照的要少。进一步研究发现，AHS病人肝细胞的线粒体DNA聚合酶POLG的表达量和线粒体DNA的含量比正常对照细胞的都要少，而且，AHS病人肝细胞ATP的产生能力也较正常对照的要弱。AHS iPSCs分化得到肝细胞AHS iPSCs-Hep其线粒体的结构也不正常，嵴变得少儿膨大，甚至有些线粒体缺少嵴。在研究VPA诱导AHSiPSCs-Hep凋亡敏感性机制时，我们发现，一种由于线粒体超氧化物的量瞬时增加而产生的超氧炫，其产生的频率比正常对照细胞要高，而这种超氧炫的产生本质上是由线粒体通透性转换孔(mPTP)的开放引起的。同时，当我们加入mPTP抑制剂时，AHS iPSCs-Hep对于VPA诱导的肝毒性的敏感性下降到正常对照的水平。本研究的这些结果说明如果把线粒体mPTP作为药物靶点设计药物，很有可能会防止AHS病人对于VPA诱导的肝毒性的发生。此外，曾报道过用于治疗VPA诱导的肝毒性的药物乙酰胆碱carnitine和N-acetylcysteine(NAC)，在本研究的疾病模型中同样可以降低AHS病人对VPA诱导的肝毒性的敏感性。总之通过AHS病人成纤维细胞来源的iPSCs建立的AHS病人的肝疾病模型的研究，揭示了AHS病人肝细胞对VPA诱导的肝毒性的机制，证明其是因为AHS病人肝细胞线粒体mPTP的开放引发的依赖线粒体途径的细胞凋亡。本研究是首次使用iPSCs建立的遗传性线粒体疾病的毒理学模型，这一模型可以为筛选治疗药物提供新的评估方法。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 线粒体疾病的研究进展

1．3 Alpers综合征的研究进展

1．4 丙戊酸(VPA)引发肝毒性的研究进展

1．5 线粒体疾病的治疗研究进展

1．6 人诱导多能干细胞疾病模型研究进展

1．6．1 诱导多能干细胞

1．6．2 遗传疾病模型及机制研究

1．7 肝细胞体外分化的研究

第二章 实验方法与实验步骤

2．1 AHS病人 iPSCs细胞的诱导

2．1．1 AHS病人细胞的获得和培养

2．1．2 AHS iPSCs细胞的诱导

2．2 AHS-iPSCs细胞的扩大培养与日常维持

2．3 AHS-iPSCs细胞的鉴定

2．3．1 突变类型以及核型的确认

2．3．2 碱性磷酸酶染色鉴定

2．3．3 免疫荧光染色

2．3．4 实时定量PCR方法鉴定内源性和外源多能性基因的表达

2．3．5 启动子去甲基化鉴定

2．3．6 AHS iPSCs细胞体外自发分化成拟胚体及鉴定

2．3．7 畸胎瘤分析

2．4 AHS iPSCs细胞体外肝分化

2．4．1 AHS iPSCs体外肝分化方法

2．4．2 AHS iPSCs来源的肝细胞的鉴定

2．5 AHS iPSCs-Hep线粒体功能相关指标检测

2．5．1 AHS iPSCs-Hep线粒体形态的电镜观察

2．5．2 AHS iPSCs-Hep线粒体形态的激光共聚焦显微镜观察

2．5．3 AHS iPSCs-Hep细胞ATP的检测

2．5．4 AHS iPSCs-Hep线粒体复合物Ⅳ的功能的检测

2．5．5 AHS iPSCs-Hep线粒体DNA含量的检测

2．5．6 Western检测AHS iPSCs-Hep线粒体DNA聚合酶POLG表达量

2．5．7 Western检测VPA处理和未处理的细胞的凋亡相关蛋白的表达情况

2．5．8 Western检测VPA处理和未处理的细胞的细胞色素c的表达情况

2．5．9 Western检测AHS iPSCs-Hep OPA1(optic atrophy 1)复合物与溶解的OPA1(soluble OPA1)的表达情况

2．5．10 AHS iPSCs-Hep乳酸和丙酮酸含量的检测

2．5．11 AHS iPSCs-Hep细胞活性氧ROS检测

2，5．1 2 AHS iPSCs-Hep谷胱甘肽含量的检测

2．5．13 质谱法检测AHS iPSCs-Hep细胞中VPA代谢产物4-ene-VPA

2．5．14 AHS iPSCs-Hep细胞线粒体超氧炫的检测

2．5．15 AHS iPSCs-Hep细胞线粒体mPTP孔道检测

2．6 药物处理AHS iPSCs-Hep以及凋亡检测

2．6．1 VPA处理分化的AHS iPSCs-Hep

2．6．2 N-乙酰半胱氨酸(NAC)，乙酰胆碱(Carnitine)处理分化的AHS iPSCs-Hep

2．6．3 环孢素CsA等抗氧化剂处理分化的AHS iPSCs-Hep

2．7 分子克隆，肝细胞过表达线粒体DNA聚合酶POLG

2．7．1 PCR扩增人POLG基因

2．7．2 POLG片段和pRLenti载体的酶切

2．7．3 酶切后的产物连接、转化、涂板、摇菌、大提质粒

2．7．4 pRLent-POLG慢病毒的包装

2．7．5 感染分化的AHS iPSCs-Hep

第三章 实验结果与实验数据

3．1 Alpers病人来源的诱导多能干细胞的获得与鉴定

3．1．1 Alpers综合征病人成纤维细胞的获得以及培养

3．1．2 AHS iPSCs的诱导

3．1．3 AHS iPSCs的鉴定

3．2 Alpets病人来源的体外诱导分化的肝细胞的获得与鉴定

3．2．1 AHS iPSCs体外定向分化为肝细胞样细胞

3．2．2 AHS PSCs分化过程中表达各个阶段特异性标志物

3．2．3 AHS iPSCs-Hep表达肝细胞特征性基因

3．2．4 AHS iPSCs-Hep具有肝脏特征性功能

3．3 AHS iPSCs-Hep在体外培养过程加入丙戊酸(VPA)处理时更容易凋亡

3．4 VPA导致AHS iPSCs-Hep的凋亡是通过线粒体途径的

3．4．1 线粒体凋亡途径的凋亡蛋白Caspase 9和Caspase 3蛋白发生剪切

3．4．2 细胞色素c的释放

3．4．3 线粒体内膜上OPA1复合体组成异常

3．5 AHS iPSCs-Hep线粒体形态与功能存在缺陷

3．5．1 电镜显示AHS iPSCs-Hep线粒体形态异常

3．5．2 AHS iPSCs-Hep核基因POLG突变仍然存在

3．5．3 AHS iPSCs-Hep线粒体DNA聚合酶表达情况

3．5．4 AHS iPSCs-Hep线粒体DNA的含量变化

3．5．5 AHS iPSCs-Hep产生ATP的功能异常

3．6 线粒体通透转运孔道(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开放产生的超氧炫(superoxide flashes)在AHS iPSCs-Hep线粒体中更加频繁

3．6．1 AHS iPSCs-Hep线粒体中的活性氧(ROS)水平研究

3．6．2 AHS iPSCs-Hep线粒体中发生超氧炫更加频繁

3．6．3 AHS iPSCs-Hep线粒体通透转运孔道(mPTP)开放频率大于Ctrl iPSCs-Hep和H1 ESCs-Hep

3．7 mPTP的抑制剂可以缓解AHS iPSCs-Hep对VPA引起的凋亡的敏感性

3．7．1 普通抑制活性氧(ROS)的抑制剂不能缓解AHS iPSCs-Hep对VPA引起的凋亡的敏性

3．7．2 mPTP的抑制剂可以缓解AHS iPSCs-Hep对VPA引起的凋亡的敏感性

3．7．3 AHS iPSCs-Hep线粒体中可能组成mPTP的复合物的组成和功能变化

3．8 传统药物乙酰胆碱(carnitine)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以缓解AHS iPSCs-Hep对VPA引起的凋亡的敏感性

3．8．1 catrintine对于VPA代谢产物4-ene-VPA的影响

3．8．2 NAC对于细胞中谷胱甘肽(GSH)的影响

3．8．3 传统药物乙酰胆碱(carnitine)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以缓解AHS iPSCs-Hep对VPA引起的凋亡的敏感性

第四章 讨论

参考文献

附录

致谢

在读期间取得的科研成果