用于治疗Alpers-Huttenlocher综合征的药物组合物

摘要

本发明公开了用于治疗Alpers-Huttenlocher综合征的药物组合物，包含该药物组合物的药物，以及上述药物和药物组合物的用途。其中，用于治疗Alpers-Huttenlocher综合征的药物组合物包含：丙戊酸钠和抗肝损伤药物，其中所述抗肝损伤药物选自环孢素A、左旋肉碱和N-乙酰半胱氨酸的至少之一。利用该药物组合物可以对Alpers-Huttenlocher综合征进行治疗，治疗效果好，并且能显著抑制肝细胞凋亡，明显减轻使用丙戊酸钠对Alpers-Huttenlocher综合征患者进行治疗时导致的急性肝衰竭，降低患者的死亡率。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及药物、药物组合物及其用途，更具体地，涉及用于治疗Alpers-Huttenlocher综合征药物组合物。

背景技术

Alpers-Huttenlocher综合征(Alpers-Huttenlocher syndrome，AHS)在临床上常常有难治性癫痫、进行性肝衰竭同时有发作性的精神运动减退等神经疾病症状。该病以婴幼儿，也可晚至青少年发病,甚至有报道25岁发病(Simonati A et al.,2003；Hunter MF ea al.,2011)。丙戊酸钠(Sodium Valproate,VPA)是一种广谱抗癫痫的药物，它对治疗癫痫具有良好的效果，但是使用VPA对AHS患者进行治疗时诱发高死亡率，研究发现，服用VPA的患者死亡率高达1/3。

因而，治疗Alpers-Huttenlocher综合征的药物有待于进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种用于预防和治疗Alpers-Huttenlocher综合征的药物组合物，该药物组合物能高显著减轻VPA单独用药引起的肝细胞凋亡。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

AHS患者施用VPA易导致急性肝衰竭，诱发高死亡率的情况，严重限制了VPA的临床应用。发明人经大量实验研究发现，肝衰竭与患者施用VPA后肝细胞易于通过线粒体途径发生自发凋亡异常升高有关。线粒体上的通透性转换孔道(mPTP孔道)具有重要的生理功能，发明人将mPTP孔道设计成药物靶点，与VPA联合施用，利用CsA对mPTP的抑制作用，从而抑制VPA对AHS患者肝细胞的毒性，实验结果表明CsA与VPA联合施用可以显著提高VPA治疗AHS癫痫的成功率，从而提高患者的存活机率。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于治疗Alpers-Huttenlocher综合征的药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包含：丙戊酸钠和抗肝损伤药物，其中所述抗肝损伤药物选自环孢素A、左旋肉碱和N-乙酰半胱氨酸的至少之一。发明人惊奇的发现，利用该药物组合物可以对Alpers-Huttenlocher综合征进行治疗，治疗效果好，并且能显著抑制肝细胞凋亡，明显减轻单独使用VPA对AHS患者进行治疗时导致的急性肝衰竭，降低患者的死亡率。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种药物。根据本发明的实施例，该药物包括前述的药物组合物。发明人惊奇的发现，利用该药物可以对Alpers-Huttenlocher综合征进行治疗，治疗效果好，并且能显著抑制肝细胞凋亡，明显减轻使用VPA对AHS患者进行治疗时导致的患者急性肝衰竭，降低患者的死亡率。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了前述的药物组合物或前述的药物在预防和治疗Alpers-Huttenlocher综合征以及预防和治疗具有Alpers-Huttenlocher综合征相似症状的疾病的用途。由此，利用前述的药物组合物或前述的药物对Alpers-Huttenlocher综合征及其具有相似症状的疾病进行预防和治疗，能显著抑制肝细胞凋亡，明显减轻使用VPA对AHS患者进行治疗时导致的患者急性肝衰竭，降低患者的死亡率。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了选自环孢素A、左旋肉碱和N-乙酰半胱氨酸的至少之一在制备药物中的用途，所述药物用于预防或者治疗对象中丙戊酸钠所引起的肝损伤。由此，该组合物能显著抑制肝细胞的凋亡情况，明显减轻丙戊酸钠所引起的肝损伤，降低丙戊酸钠的毒副作用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的患者1AHS皮肤成纤维细胞诱导AHS iPSCs第4天的细胞状态的显微图片；

图2显示了根据本发明一个实施例的患者1的AHS iPSCs诱导分化成AHS iPSCs-Hep过程各阶段的细胞状态显微图片；

图3显示了根据本发明一个实施例的VPA处理的Ctrl、H1，患者1AHS iPSCs-Hep和患者2AHS iPSCs-Hep的细胞凋亡实验结果示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的Ctrl、H1和患者1AHS iPSCs-HepmPTP开放频率示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的分别用VPA以及VAP-CsA处理的Ctrl、H1以及患者1和患者2的AHS iPSCs-Hep的细胞凋亡实验结果示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的分别用VPA、VAP+L-Carnitine以及VPA+NAC处理的Ctrl、H1以及患者1和患者2的AHS iPSCs-Hep的细胞凋亡实验结果示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的技术方案是发明人通过大量的实验，反复地研究而获得的。AHS疾病大部分是线粒体DNA的聚合酶基因POLG突变引起线粒体DNA缺失突变导致的，目前仅发现POLG基因突变情况以及线粒体DNA的缺失突变情况，但对POLG基因突变以及线粒体DNA的缺失突变怎样引起线粒体功能缺陷而导致细胞易于凋亡的研究存在空白，发明人进行了大量的实验，对凋亡的病理原因进行研究，从而获得了针对VPA治疗Alpers-Huttenlocher综合征导致肝损伤的治疗靶点。

首先，发明人对线粒体途径的细胞凋亡进行检测。发明人进行AnnexinV-FITC和PI双染实验，通过流式细胞仪分析的方法检测肝细胞凋亡，研究发现分化得到的肝细胞会自发凋亡，而且AHS肝细胞更易自发凋亡，VPA处理后肝细胞凋亡都有所提高但是AHS肝细胞的凋亡率远高于正常人的肝细胞。这可能是AHS患者往往伴随着肝衰竭，且用VPA对患者进行治疗后出现急性肝衰竭症状的原因。

为找出AHS患者细胞凋亡水平高的原因，发明人检测了与细胞凋亡密切相关的线粒体mPTP孔道的开放情况。利用Calcein-氯化钴实验进行检测，结果发现AHS肝细胞中calcein染料的绿色荧光最弱，荧光值越弱表示mPTP孔道开放频率越高，该结果表明AHS肝细胞线粒体mPTP孔道开放频率明显大于正常人的肝细胞。

基于上述实验，发明人将mPTP设计成的药物靶点。CsA是线粒体mPTP孔道开放的抑制剂，用CsA处理能显著提高AHS，Ctrl和H1肝细胞的荧光，降低肝细胞线粒体mPTP孔道开放。发明人将CsA与VPA作为药物组合物，对Alpers-Huttenlocher综合征进行治疗，发现该组合物对AHS患者的治疗效果好，并且能显著抑制肝细胞凋亡，明显减轻使用VPA对AHS患者进行治疗时导致的患者急性肝衰竭，降低患者的死亡率。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于治疗Alpers-Huttenlocher综合征的药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包含：丙戊酸钠和抗肝损伤药物，其中所述抗肝损伤药物选自环孢素A、左旋肉碱和N-乙酰半胱氨酸的至少之一。发明人惊奇的发现，利用该药物组合物可以对Alpers-Huttenlocher综合征进行治疗，治疗效果好，并且能显著抑制肝细胞凋亡，明显减轻使用VPA对AHS患者进行治疗时导致的急性肝衰竭，降低患者的死亡率。

本发明中所使用的术语“抗肝损伤药物”是指与丙戊酸钠作为药物组合物共同使用，用于减轻单独使用VPA在预防和治疗Alpers-Huttenlocher综合征，和具有Alpers-Huttenlocher综合征相似症状的疾病时，引起的肝损伤。由此，抗肝损伤药物的种类不受特别的限制，只要与VPA共同使用，相对于VPA单独使用，在用于预防和治疗Alpers-Huttenlocher综合征，和具有Alpers-Huttenlocher综合征相似症状的疾病时，能减轻肝损伤即可，例如，本发明实施例采用的环孢素A、左旋肉碱和N-乙酰半胱氨酸。

根据本发明的实施例，丙戊酸钠与抗肝损伤药物的摩尔比是本发明药物组合物的重要技术特征之一。一般而言，在本发明的药物组合物中，丙戊酸钠与所述抗肝损伤药物的摩尔比为2000：1-2：1。根据本发明的具体示例，丙戊酸钠和环孢素A的摩尔比为2000：1-500：1，其中，摩尔比为1000：1药物效果更佳。根据本发明的具体示例，丙戊酸钠和左旋肉碱的摩尔比为50：1-2：1，其中，摩尔比为4：1时，药物效果更佳。根据本发明的具体示例，丙戊酸钠和N-乙酰半胱氨酸的摩尔比为100：1-2：1，其中，摩尔比为20：1时，药物效果更佳。

本发明中丙戊酸钠与抗肝损伤药物的摩尔比可以根据所选配伍药物、给药方式和适应症的不同而研究出最佳摩尔比。由此，药物组合物对Alpers-Huttenlocher综合征的治疗效果好，对肝损伤小。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种药物。根据本发明的实施例，该药物包括前述的药物组合物。发明人惊奇的发现，利用该药物可以对Alpers-Huttenlocher综合征进行治疗，治疗效果好，并且能显著抑制肝细胞凋亡，明显减轻使用VPA对AHS患者进行治疗时导致的急性肝衰竭，降低患者的死亡率。

根据本发明的实施例，所述药物的给药剂量不受特别的限制，可以根据配伍药物、施药对象、适应症进行调整。优选地，所述药物的给药剂量为：丙戊酸钠：15-40mg/kg，环孢素A:3-10mg/kg，左旋肉碱:3-15mg/kg，N-乙酰半胱氨酸：5-15mg/kg。由此，对疾病的治疗效果好。更优选地，所述药物的给药剂量为：丙戊酸钠：25mg/kg，环孢素A：5mg/kg，左旋肉碱：7mg/kg，N-乙酰半胱氨酸：10mg/kg。由此，对疾病的治疗效果更佳。

根据本发明的实施例，所述药物的剂型不受特别的限制，只要能包载所述药物进行给药即可。根据本发明的一些具体示例，所述药物所述药物的剂型选自注射液、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、气雾剂以及喷雾剂之一。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了前述的药物组合物或前述的药物在预防和治疗Alpers-Huttenlocher综合征以及预防和治疗具有Alpers-Huttenlocher综合征相似症状的疾病的用途。由此，利用前述的药物组合物或前述的药物对Alpers-Huttenlocher综合征及其具有相似症状的疾病进行预防和治疗，能显著抑制肝细胞凋亡，明显减轻使用VPA对AHS患者进行治疗时导致的急性肝衰竭，降低患者的死亡率。

需要说明的是，Alpers-Huttenlocher综合征(AHS)是线粒体DNA聚合酶基因POLG突变引起的线粒体疾病，多发于婴幼儿期，临床常常有癫痫和进行性肝衰竭，同时有发作性的精神运动减退等神经疾病症状。具有Alpers-Huttenlocher综合征相似症状的疾病包括具有上述癫痫、发作性的精神运动减退等神经疾病症状至少之一的疾病。优选地，所述具有Alpers-Huttenlocher综合征相似症状的疾病为癫痫、小舞蹈病、偏头痛、顽固性呃逆、躁狂症和心律失常。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了选自环孢素A、左旋肉碱和N-乙酰半胱氨酸的至少之一在制备药物中的用途，所述药物用于预防或者治疗对象中丙戊酸钠所引起的肝损伤。由此，该组合物能显著抑制肝细胞的凋亡情况，明显减轻丙戊酸钠所引起的肝损伤。

根据本发明的实施例，所述对象患有Alpers-Huttenlocher综合征。由此，该组合物对肝损伤的治疗效果好。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

本实施例中，利用成纤维细胞诱导为多能干细胞，进而分化为肝细胞。采用的四株肝细胞分别是：2株来自AHS患者的多能干细胞分化的肝细胞(AHS iPSCs-derived hepatocytes),简称AHS肝细胞，分别来源于患者1和患者2(患者1的成纤维细胞由瑞士伯尔尼大学，人类遗传学部门AndréSchaller教授惠赠，患者2的成纤维细胞由法国楚里昂生物科学中心Bénédicte Mousson de Camaret教授惠赠)。另外两株是对照肝细胞，分别是健康人的多能干细胞分化的肝细胞(Control iPSCs-derived hepatocytes)简称Ctrl肝细胞，来源于健康人的成纤维细胞，(中国科学院广州生物医药与健康研究院再生生物学重点实验室获得和储存)，利用该成纤维细胞能够诱导为多能干细胞，再分化为肝细胞，以及发明人存储的干细胞H1ESCs(中国科学院广州生物医药与健康研究院再生生物学重点实验室存储)分化的肝细胞(H1 ESCs-derived hepatocytes)，简称为H1肝细胞。下面以患者1为例，由成纤维细胞诱导成肝细胞的过程如下：

1、AHS患者细胞的获得和培养

收集AHS患者1的皮肤成纤维细胞，将AHS患者1的皮肤成纤维细胞常规培养一周左右传代，培养基成份为MEM(Gibco公司)+10％FBS+1％NEAA+1％丙酮酸钠+1％双抗+200mM尿苷。待扩增一定量时用冻存液(90％FBS+10％DMSO)冻存于液氮。

2、AHS iPSCS细胞的诱导

AHS iPSCs诱导试验包括病毒包装、感染、分盘、克隆挑取等环节，具体步骤如下：

1)病毒包装

培养293T细胞，当293T细胞密度约80％时进行磷酸钙转染，加入包装质粒pLC(中国科学院广州生物医药与健康研究院再生生物学重点实验室保存)，再依次加入质粒pMXs-hOCT4/hSOX2/hKLF4/hc-MYC(addgene购买，质粒编号依次分别为#17964，#17218，#17219，#17220)，用pMXs-GFP质粒(中国科学院广州生物医药与健康研究院再生生物学重点实验室构建，由pMXs-hOCT4质粒将hOCT4基因替换成GPF基因)作为对照，分别按照目的质粒：包装质粒＝20μg:20μg比例混匀转染，第二天上午更换转染培养基，转然后48h后用于收集逆转录病毒。

2)收集病毒、感染

收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤，补加聚凝胺(polybrene，终浓度8μg/ml)，混匀。每盘再加入8ml 293T培养基，用于第二次病毒收集。

6孔板中，将AHS成纤维细胞平均分成2份加入孔1和孔2中，贴壁过夜后感染病毒。将AHS成纤维细胞培养基替换为新鲜培养基后，孔1的AHS成纤维细胞只加入pMX-GFP病毒，该病毒由pMXs-GFP质粒转染293T细胞后取上清获得，使病毒的感染复数(MOI)为6，作为感染对照，如果上面质粒包装出的病毒没问题，能正常感染细胞的话那么病毒中的GFP蛋白将会表达，在荧光显微镜下就能看到细胞发出绿色荧光。那么下面孔2同时操作得到的四种病毒也能正常感染细胞表达相应的目的蛋白。孔2加入SOX2，KLF4，OCT3/4，c-MYC四种病毒(四种病毒简称为SKOM)，这四种病毒是上面质粒pMXs-hOCT4/hSOX2/hKLF4/hc-MYC转染293T细胞后取上清获得的，使每种病毒的感染复数(MOI)为6。感染过夜后换新鲜AHS培养基。当天晚上进行病毒二次感染，步骤同上。

感染第2天到第6天，更换DFBS培养基(人干细胞培养基)，同时准备饲养层细胞，其中，感染第4天利用显微镜观察细胞的状态，细胞的生长状态如图1所述，感染pMX-GFP病毒细胞形态没有明显变化，细胞状态良好，在荧光显微镜下能够看到细胞发绿色荧光，说明包装的病毒是没有问题的，病毒能正常感染细胞表达GFP蛋白，处理组感染SKOM四种病毒的细胞在第四天在显微镜下观察发现细胞状态良好，但细胞发生形态变化，从梭形变为圆形并逐渐聚集向多能性干细胞(iPS)方向发展。感染第6天开始分盘，将感染后的细胞，消化计数，每个铺有饲养层的10cm盘接种20，000或30，000个细胞，接种用DFBS培养基。以后每天更换培养基，培养基中添加VPA(1mM，购自CALBIOCHEM，货号676380)和Vc(50μg/ml，购自Sigma公司，货号1043003)，在感染后30天，在显微镜下观察细胞会出现一个鸭蛋形的hESCs-like(人类胚胎干细胞样的细胞)克隆即iPS细胞，挑取hESCs-like克隆到12孔板中，然后待克隆长大以后再以机械法扩大培养，获得AHS iPSCs细胞。

3、AHS iPSCs诱导分化成AHS iPSCs-Hep(多能干细胞分化的肝细胞)

采用无血清体系，将AHS iPSCs定向分化为肝细胞，具体步骤如下：

(1)当AHS iPSCs长到80％汇合，细胞进行1：1传代，传代前用Matrigel包被板37℃过夜。

(2)传代后的AHS iPSCs长满后进行肝细胞定向分化

(3)肝细胞定向分为4个阶段：定型内胚层(definitive endoderm，DE)定向，肝前体定向、扩增和肝细胞成熟。如图2所示，以机械法扩大培养得到的AHS iPSCs细胞铺到六孔板后培养的第1天记为Day 0，到Day3，细胞开始聚集，内胚层样的细胞开始出现，用免疫荧光可以检测到内胚层特异表达的FOXA1蛋白，表明细胞分化到内胚层阶段，到Day13，细胞开始出现明显的轮廓，用免疫荧光可以检测到肝祖细胞特异表达的AFP蛋白，表明细胞分化到肝前体阶段，到Day21天，细胞的轮廓更加分明呈规则的六边形并可以检测到肝细胞特异表达的ALB蛋白，到这时得到分化好的肝细胞可以进行后续的实验。

采用上述方法，对患者2的成纤维细胞，健康人的成纤维细胞和H1的多能干细胞进行处理，分别获得患者2 AHS iPSCs-Hep、Ctrl iPSCs-Hep和H1 iPSCs-Hep细胞。

实施例2

利用VPA药物处理由实施例1获得的Ctrl iPSCs-Hep、H1 iPSCs-Hep，患者1AHSiPSCs-Hep和患者2AHS iPSCs-Hep，检测细胞的凋亡情况。

本实验中，用VPA处理分化而来的AHS iPSCs-Hep和正常对照的分化肝样细胞，分别处理0小时，12小时，24小时用Annexin V凋亡试剂盒检测凋亡。本实验使用的检测凋亡的试剂盒购买自Roche公司，货号是11858777001。操作步骤如下：

1.将分化好的肝细胞用VPA处理，分别处理0小时，12小时和24小时。

2.收集VPA处理后的细胞，每个孔用300μl的0.25％胰酶处理20分钟，用500μl含血清的培养基终止，吹下细胞转移到1.5ml的EP管中。用离心机300g离心，离心5分钟后收集细胞。

3.配制染色液，1ml的孵育液中加入20μl的Annexin-V-FLUOS染料和20ul的PI染料，配好染色液后在每个EP管加100ul的染色液。

4.在室温下孵育15分钟，每个EP管加200ul的孵育液，如果细胞量过多需要加300-400μl的孵育液，使细胞浓度到达1X10⁶个/ml左右。

5.使用流式细胞仪进行检测，检测使用的激发光分别是488nm和535nm，检测1万个细胞，被Annexin-V-FLUOS染料染色而不会被PI染料染色的细胞为凋亡的细胞，计算这类细胞的数量得到凋亡的细胞数量并进行统计，数据处理结果如图3所示，在0小时的时候患者AHS iPSCs-Hep细胞凋亡的数量和对照细胞(Ctrl iPSCs-Hep和H1 iPSCs-Hep)相似，在VPA处理12小时后，患者肝细胞凋亡的数量开始明显的比对照细胞多，到VPA处理24小时患者肝细胞出现大量的凋亡，比对照肝细胞多出2-4倍左右。在VPA处理过程中，对照细胞的凋亡只有少量的增加，这些结果表明VPA处理会引起患者肝细胞的大量凋亡。

实施例3

采用钙黄绿素释放实验(Calcein release assay)方法，检测实施例1获得的Ctrl、H1和患者1AHS iPSCs-Hep线粒体mPTP的开放频率。该方法的原理是用Calcein转染上述iPSCs-Hep细胞，细胞会发绿色荧光，加入CoCl₂时，在细胞内CoCl₂会结合漂白Calcein使细胞失去荧光(在细胞外CoCl₂和Calcein不反应，Calcein可以无障碍的进入线粒体，但是CoCl₂只能通过mPTP进入线粒体，所以线粒体中的Calcein的荧光强度代表mPTP开放的频率，开放频率越高CoCl₂进入线粒体就越多，被结合漂白的Calcein就越多，那么细胞的荧光就越弱，所以经过CoCl₂漂白后细胞的荧光越弱代表mPTP开放的频率越高。在这里我们同时用环孢素A(CsA)处理细胞，检测CsA在肝细胞中能否发挥作用，所以下面的实验我们把细胞分成两组进行处理，第一组：加Calcein和CoCl₂，第二组：加Calcein，CoCl₂和CsA(20uM)。mPTP开放的检测试剂盒购买自Invitrogen，货号是I35103，按照试剂盒说明书进行操作，具体方法如下：

1.按照试剂盒说明书用DMSO将Calcein配成1mM，CoCl₂不需要配制。用PBS缓冲液配两组的染色液，1ml的PBS中，第一组加1μl的Calcein的染色液和15μl的CoCl₂，第二组加Calcein，CoCl₂和CsA(20μM)。

2.将分化好的肝细胞用PBS清洗细胞2次，每种肝细胞分别加入上面两组的染色液，每个6cm盘用1ml的染色液孵育15min。

3.去掉染色液用PBS洗细胞两次，用4％的多聚甲醛固定15min。

4.去掉4％的多聚甲醛，用PBS洗细胞两次，加入PBS，使用激光共聚焦对细胞进行拍照，激发光为488nm。

用共聚焦采集荧光后，采用荧光分析软件，计算每个细胞的绿色荧光值。

5.数据处理：对细胞的荧光值进行统计，结果如图4所示，图4A中患者细胞(患者1AHSiPSCs-Hep)的荧光强度明显低于对照细胞(Ctrl iPSCs-Hep和H1 ESCs-Hep)，表明患者细胞的mPTP开放频率高于对照细胞。图4B中，患者1的细胞中加CsA后，患者细胞的荧光强度显著提高，但是对照细胞中加入CsA后荧光强度只有少量的变化，表明CsA可以使患者细胞mPTP的开放频率明显的降低。

实施例4

CsA(20μM，购自Sigma公司，货号C1832)药物和VPA(20mM)同时处理患者1和患者2的AHS iPSCs-Hep以及对照细胞Ctrl和H1，以便观察细胞的mPTP的开放频率和细胞凋亡情况。

将CsA同VPA一起处理AHS iPSCs-Hep和对照细胞，采用Calcein release assay方法，按照实施例3的步骤检测线粒体mPTP开放频率，实验结果与实施例3的钙黄绿素释放实验结果相似，mPTP开放频率显著降低，并在24小时后用Annexin V试剂盒(Roche公司，货号11858777001)用流式细胞仪检测凋亡细胞的比例，结果如图5所示，在对照细胞中CsA对凋亡没有明显的影响，但是在患者1和患者2细胞中CsA能显著的抑制VPA引起的细胞凋亡。因此，CsA能抑制iPSCs-Hep线粒体mPTP开放并缓解VPA对AHS iPSCs-Hep的凋亡毒性。

实施例5

药物左旋肉碱(L-carnitine，5mM)或者N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，1mM)和VPA(20mM)同时按照实施例4的步骤处理患者1和患者2的AHS iPSCs-Hep和对照细胞Ctrl和H1。在24小时后用Annexin V试剂盒(Roche公司，货号11858777001)用流式细胞仪检测凋亡细胞的比例，结果如图6所示，L-carnitine和N-acetylcysteine可以抑制患者1和2 AHS iPSCs-Hep对于凋亡的敏感性，同时对对照细胞没有影响，并且，L-carnitine或者N-acetylcysteine单独处理AHS iPSCs-Hep和对照细胞，对于细胞的凋亡都没有影响。

总结

通过实施例1-5证明，丙戊酸钠的处理使AHS患者肝细胞凋亡显著上升与线粒体的mPTP开放频率提高有关，利用本发明的药物组合物治疗AHS，该组合物中的丙戊酸钠和抗肝损伤药物具有协同作用，可以显著降低丙戊酸钠的毒副作用，减轻肝损伤，提高药物的治疗效果，降低病人的死亡率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。