分枝杆菌BD696-6固定化发酵产雄烯二酮的研究

摘要

雄烯二酮(AD)是合成甾体激素类药物不可替代的中间体，随着薯芋皂素资源日渐枯竭，利用微生物发酵生产AD是目前研究的热点课题之一。菌株Mycobacterium sp. BD696-6(简称BD696-6)可转化植物甾醇为雄烯二酮，但其发酵过程中存在菌体浓度低、发酵周期长、转化率低等缺点。许多研究表明，固定化技术能有效保护细胞膜的完整性，促进目标产物的积累。本论文采用海藻酸钠包埋法和硅藻土吸附法固定菌体细胞，探索固定化条件及发酵条件对分枝杆菌BD696-6发酵产AD的影响，主要研究结果如下。 在单因素试验基础上，正交实验优化得到菌株BD696-6的最适固定化条件，海藻酸钠浓度3g/100mL、CaCl2浓度1g/100mL、菌体包埋量15mL/50mL凝胶，静置固化时间1h；该条件下进行菌株BD696-6固定化细胞与游离细胞对比试验，发酵周期由168h缩短为144h，AD转化率提高了17.93％。对固定化菌株BD696-6发酵条件进行的研究结果表明，将20mL凝胶菌体混合液装入50mL转化培养基/250mL摇瓶、发酵温度32℃、初始pH8.5、摇床转速230r/min、甾醇添加量5 g/L时，AD转化率最高达80.83％，且固定化细胞具有较好的贮存稳定性和可重复利用性。扫描电镜显示以海藻酸钠为包埋载体时，营养物质可自由传输。 以硅藻土作为菌株BD696-6吸附载体，经吸附固定后，通过正交试验获得硅藻土吸附固定化细胞的条件为载体添加量7g/L、最佳接种量18％、甾醇添加量3g/L、发酵时间168h，AD转化率达到81.47％，比游离细胞发酵AD转化率提高了19.82％。对硅藻土吸附固定细胞发酵条件的研究表明，较适的摇床转速200r/min、发酵温度32℃、初始pH8.7、甘氨酸添加量4g/L发酵培养基，表面活性剂吐温-80对发酵影响不大，金属离子Fe2+、Zn2+、Mg2+对AD转化率有明显的促进作用，其中加入FeSO4·7H2O0.1g/L，AD转化率最高，其值为85.64％。 5L发酵罐中进行放大试验的结果表明，以硅藻土为载体，加入甾醇5g/L时，AD转化率达到95.21％。

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文摘

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致谢

第一章引言

1.1雄烯二酮的性质、应用及生产方法

1.1.1雄烯二酮的结构与性质

1.1.2雄烯二酮的应用

1.1.3雄烯二酮的生产方法

1.2微生物发酵生产雄烯二酮的研究进展

1.2.1微生物生产雄烯二酮的常用菌种

1.2.2分枝杆菌发酵产雄烯二酮的研究现状

1.2.3细胞固定化技术的应用

1.3课题研究意义及主要研究内容

1.3.1研究目的和意义

1.3.2主要研究内容

第二章海藻酸钠固定BD696-6菌株转化甾醇产雄烯二酮的研究

2.1材料与方法

2.1.1菌种

2.1.2主要试剂与设备

2.1.3培养基和培养条件

2.1.4实验方法

2.2实验方案设计

2.2.1单因素对菌株海藻酸钠固定化效果的影响

2.2.2菌株海藻酸钠固定化条件筛选的正交试验

2.2.3影响海藻酸钠固定化BD696-6菌株发酵效果的实验方案

2.2.4海藻酸钠固定化细胞转化甾醇产雄烯二酮的稳定性考察

2.2.5海藻酸钠固定化BD696-6菌株细胞的检测

2.3结果与讨论

2.3.1菌株海藻酸钠固定化单因素实验结果

2.3.2菌株海藻酸钠固定化条件筛选的正交试验结果与分析

2.3.3海藻酸钠固定化BD696-6菌株的发酵条件

2.3.4海藻酸钠固定化BD696-6细胞稳定性考察结果

2.3.5菌株BD696-6固定化细胞扫描电镜检测结果

2.4本章小结

第三章硅藻土吸附固定化BD696-6菌株效果的研究

3.1材料与方法

3.1.1菌种

3.1.2主要试剂与设备

3.1.3培养基与培养条件

3.1.4实验方法

3.2实验方案

3.2.1吸附固定化载体的筛选

3.2.2硅藻土吸附细胞BD696-6的扫描电镜检测

3.2.3硅藻土吸附固定化细胞效果的单因素实验

3.2.4硅藻土吸附固定化细胞的正交实验

3.2.5硅藻土固定化细胞操作稳定性考察

3.2.6凝胶包埋法和物理吸附固定法的对比试验

3.3结果与讨论

3.3.1吸附法固定化载体筛选结果

3.3.2硅藻土吸附细胞BD696-6的扫描电镜检测结果

3.3.3硅藻土吸附固定化细胞单因素试验结果

3.3.4硅藻土吸附固定化细胞最适条件

3.3.5重复利用效果

3.3.6固定化方法的确定

3.4本章小结

第四章硅藻土固定化细胞发酵条件的研究

4.1材料与方法

4.1.1菌种

4.1.2主要试剂与设备

4.1.3培养基和培养条件

4.1.4实验方法

4.2实验方案

4.2.1硅藻土固定化细胞摇床发酵条件试验

4.2.2 5L罐放大试验

4.3结果与讨论

4.3.1摇床发酵条件的确定

4.3.2 5L罐放大试验效果分析

4.4本章小结

第五章结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文