声明
致谢
摘要
第一章绪论
1．1．1磷脂酶简介
1．1．2磷脂酶A1简介
1．2外膜磷脂酶A简介
1．2．1外膜磷脂酶A的结构
1．2．2外膜磷脂酶A的催化机制
1．2．3外膜磷脂酶A的激活机制
1．3微生物磷脂酶分子生物学研究
1．4磷脂酶的修饰
1．4．1磷脂酶的化学修饰
1．4．2磷脂酶的固定化
1．5本课题的研究背景、意义及主要内容
1．5．1研究背景
1．5．2研究意义及目的
1．5．3主要内容
1．5．4项目资助
1．5．5主要技术路线框架图
第二章外膜磷脂酶A1(OM-PLA1)基因克隆及原核表达
2．1．1质粒与菌株
2．1．2试剂
2．1．3主要仪器
2．2试验方法
2．2．1溶液的配制
2．2．2粘质沙雷氏菌总基因组的提取
2．2．3外膜磷脂酶A1基因的PCR扩增及回收
2．2．4 PCR产物的连接与转化
2．2．5质粒提取及测序鉴定
2．2．6外膜磷脂酶A1基因生物学信息分析
2．2．7重组质粒转化BL21
2．2．8原核诱导表达重组外膜磷腊酶A1
2．2．9重组外膜磷脂酶A1酶活力测定
2．2．10粗酶液纯化及SDS-PAGE鉴定
2．2．11外膜磷脂酶A1原核表达条件优化
2．2．12重组外膜磷脂酶A1的酶学特性研究
2．2．13重组外膜磷脂酶A1的菜籽油脱胶应用
2．3结果与分析
2．3．1目的基因的扩增
2．3．2菌落PCR鉴定
2．3．3测序鉴定
2．3．4蛋白进化树的构建
2．3．5生物学信息分析
2．3．6重组蛋白的纯化及SDS-PAGE鉴定
2．3．7重组外膜磷脂酶A1诱导表达优化
2．3．8重组外膜磷脂酶A1酶学特性研究
2．3．9酶法脱胶条件优化
2．4本章小结
第三章外膜磷脂酶A1(OM-PLA1)基因在毕赤酵母中的表达、固定化及菜籽油脱胶
3．1．1菌株与质粒
3．1．2所用试剂
3．1．3主要仪器
3．2．1溶液的配制
3．2．2表达载体的构建
3．2．3表达载体转化P．pastoris GS115
3．2．4转化子表型筛选
3．2．5重组毕赤酵母的鉴定
3．2．6重组外膜磷脂酶A1在毕赤酵母中的表达
3．2．7重组毕赤酵母的发酵条件优化
3．2．8 Fe3O4／氧化石墨烯的制备及外膜磷脂酶A1的固定化
3．2．9固定化外膜磷脂酶A1菜籽油脱胶应用
3．2．10固定化外膜磷脂酶A1酶法脱胶条件优化
3．2．11固定化外膜磷脂酶A1的回收和再利用
3．3．1目的基因PCR扩增及纯化回收
3．3．2表达载体pPIC9K-His-OM-PLA1的构建
3．3．3重组毕赤酵母的构建与表型筛选
3．3．4重组毕赤酵母PCR鉴定
3．3．5重组P．pastoris表达外膜磷脂酶A1的酶活测定
3．3．6重组外膜磷脂酶A1的纯化及SDS-PAGE
3．3．7重组毕赤酵母发酵条件优化
3．3．8 Fe3O4氧化石墨烯表征分析
3．3．9固定化外膜磷脂酶A1固定化条件优化
3．3．10 pH和温度对固定化外膜磷腊酶A1酶活力的影响
3．3．11固定化外膜磷脂酶A1贮藏稳定性研究
3．3．12菜籽油脱胶条件优化
3．3．13固定化外膜磷脂酶A1的回收和利用
3．4讨论
3．5本章小结
第四章结论与展望
4．1结论
4．2展望
参考文献
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况
