基于生物传感器的MERS冠状病毒蛋白酶检测模型及其应用

摘要

背景：新发中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）严重威胁人类健康，致死率远高于2003年的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)，达40％以上。最近一次大爆发是去年5月份，在韩国引起了183人感染，死亡33人。冠状病毒是一种广泛存在，重组率高，种类繁多，主要诱发人类呼吸系统疾病的病毒，目前抗冠状病毒药物研究还远远不够。控制病毒复制的复制酶复合体（RC）的形成依赖其主要蛋白酶(木瓜样蛋白酶PLpro和3C样蛋白酶3CLpro)，而这两种蛋白酶是冠状病毒所特有，在人体内并没有与其相似或相同的蛋白，抑制病毒蛋白酶催化功能就可有效抑制病毒对底物的切割，从而阻断病毒复制。本课题设想通过构建一个基于荧光素酶报告系统的生物传感器，能够在细胞水平对冠状病毒蛋白酶作用机制进行模拟，检测蛋白酶对非结构蛋白体的切割活性，进一步利用该模型高灵敏度、高通量地筛选蛋白酶抑制剂。以此生物传感系统及蛋白酶特异性切割的原理进一步研究PLpro和3CLpro结构并筛选蛋白酶抑制剂，为抗冠状病毒药物研究奠定基础。
　　目的：建立基于生物传感器的冠状病毒蛋白酶活性测定模型，利用该模型研究人类MERS-CoV PLpro和3CLpro对催化底物及保守序列的识别特性，比较不同冠状病毒蛋白酶活性的差异。并进一步利用建立的模型进行抗病毒蛋白酶抑制剂筛选，为抗人类冠状病毒药物筛选提供研究基础。
　　方法：首先，合成MERS-CoV PLpro和MERS-CoV3CLpro以及其各自底物pGlo-30F-M-nsp1/2，2/3，3/4(PLpro)，4/5，5/6，6/7，7/8(3CLpro)的生物传感器基因构建体。其次，利用PCR定点突变试剂盒将PLpro/3CLpro蛋白酶催化活性中心Cys-His-Asp(PLpro)/His-Cys(3CLpro)分别突变为Ala，从而构建蛋白酶活性缺失突变体，同时构建酶切底物pGlo-30F-M-nsp2/3，pGlo-30F-M-nsp7/8各识别位点的相应突变体。再次，利用双荧光素酶报告基因检测法测定MERS PLpro/3CLpro蛋白酶对底物的识别功能，比较不同冠状病毒蛋白酶活性差异，并使用蛋白印迹法检测蛋白酶在细胞内的表达量。最后利用基于荧光素酶的冠状病毒蛋白酶活性检测的生物传感器筛选冠状病毒蛋白酶候选抑制剂。
　　结果：1.成功构建 MERS PLpro蛋白酶生物传感器，其主要部件包括 MERS PLpro、基因工程构建携带蛋白酶底物序列的传感器质粒，该模型作用原理是质粒共转HEK293T细胞表达后，蛋白酶识别切割底物，使得连接底物传感器的荧光素酶发生构象变化，两个亚基结合到一起，从而激活荧光素酶底物释放荧光，一旦不识别则构象变化受到限制，难以激活荧光素酶，释放的荧光量显著较低。通过检测荧光量间接表现蛋白酶的活性。该模型对不同底物切割的特异性，验证了该传感器模型成功建立。
　　2.应用MERS PLpro蛋白酶的生物传感器，研究验证MERS PLpro特异性识别切割非结构蛋白位点：在HEK293T细胞中，MERS PLpro切割蛋白酶底物nsp2/3和nsp3/4更彻底，不完全切割底物nsp1/2。分别突变MERS PLpro各个蛋白酶催化活性位点后，发现蛋白酶对底物的识别切割效率显著降低。此外，实验结果显示当传感器底物pGlo-30F-M-nsp2/3的识别序列突变后，PLpro对位点LVGG的突变底物识别切割效率也明显减弱。提示MERS-CoV PLpro特异性识别并切割底物，且识别位点高度保守序列，此切割作用依赖PLpro蛋白酶催化位点。
　　3.不同冠状病毒PLpro蛋白酶活性研究：使用MERS-CoV的传感器底物，比较了SARS/MERS PLpro和PEDV/NL63 PLP2的识别切割效率。结果显示，SARS和MERS两种冠状病毒的PLP蛋白酶存在很大相似性，而PEDV对其底物的切割效率较低，提示这种显著的切割差异可能与病毒的种属差异相关。
　　4.成功构建MERS3CLpro蛋白酶生物传感器，组成部分包括MERS3CLpro、基因工程构建的携带蛋白酶底物序列传感器质粒，通过对底物切割，验证了3CLpro蛋白酶生物传感器模型成功建立。应用MERS3CLpro蛋白酶的生物传感器，研究了MERS3CLpro特异性地切割释放底物蛋白：在HEK293T细胞中，MERS3CLpro切割蛋白酶底物nsp5/6和nsp7/8更彻底，不完全切割底物nsp6/7。分别突变MERS3CLpro的两个催化活性位点后，发现对各个蛋白酶底物的识别切割效率显著降低。此外，实验结果显示当传感器底物pGlo-30F-M-nsp7/8的识别序列突变后，3CLpro对位点LQA的突变底物识别切割效率也明显减弱。提示MERS-CoV3CLpro特异性识别并切割底物蛋白的高度保守序列，且此切割作用依赖 PLpro蛋白酶催化位点。
　　5.不同冠状病毒3CLpro蛋白酶活性研究：分别使用SARS和MERS两种冠状病毒的传感器底物，比较了SARS和MERS3CLpro的识别切割效率。结果显示， SARS和MERS两种冠状病毒的3CL蛋白酶对不同底物的切割效率的趋势一致，由此可见冠状病毒蛋白酶功能的保守性，另外相比较而言 SARS蛋白酶的切割活性较高，也可反映出切割效率与病毒传播快慢的关系。
　　6.基于以上研究基础，本课题应用MERS PLpro和3CLpro两个生物传感器筛选了大量的化合物，包括小分子抗 SARS药物、天然提取药物等，目前初步得到能够抑制MERS3CLpro活性的SARS3CLpro蛋白酶抑制剂Cinaserin。
　　结论：本研究成功构建了基于生物传感器的MERS-CoV蛋白酶活性测定模型。应用该模型验证了MERS蛋白酶PLpro和3CLpro对底物的识别切割依赖其催化位点，而且MERS-CoV蛋白酶的识别底物序列具有保守性。不同冠状病毒蛋白酶对底物的切割具有差异性，推断该差异性可能与宿主种属以及病毒传播特性有关。进一步利用该模型初步筛选获得了抗 MERS冠状病毒蛋白酶候选抑制剂Cinaserin。本研究为研究冠状病毒蛋白酶结构与功能以及新型抗病毒药物筛选奠定了基础。

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1 引言

2 实验材料

2.1 细胞株

2.2 质粒

2.3 主要试剂

2.4 主要仪器和设备

2.5 主要溶液及试剂配制

3 实验方法

3.1 MERS-CoV 3CLpro及其突变体的构建

3.2 pGlo-30F-Substrates的构建

3.3 pGlo-30F-Substrates识别位点突变体的构建

3.4 双荧光素酶报告基因检测MERS PLpro/3CLpro及其突变体活性

3.5 Western blotting分析蛋白表达量

3.6 统计学分析

4 结果

4.1 MERS-CoV基因组结构和蛋白酶及其识别位点

4.2 生物传感器模型的原理及相关寡核苷酸的合成

4.3 基于生物传感器的MERS-CoV PLpro蛋白酶活性测定模型建立

4.4 应用PLpro生物传感器比较不同冠状病毒 PLP蛋白酶活性

4.5 基于生物传感器的MERS-CoV 3CLpro蛋白酶活性检测模型

4.6 比较MERS和SARS 3CLpro蛋白酶活性的差异

4.7 Cinaserin能够抑制多种冠状病毒3CLpro蛋白酶活性

5 讨论

6 结论

参考文献

附录 个人简历

致谢

综述: 抗冠状病毒药物筛选方法的研究进展