Cathepsin B对脑外伤引起的自噬及线粒体途径介导的细胞死亡的影响

摘要

目的：有文献报道溶酶体酶在缺血与神经毒的神经元死亡中发挥着重要作用，我们的研究也证实了脑外伤后自噬被激活，cathepsin B表达显著增加。本研究主要探索一种cathepsin B选择性抑制剂CBI对脑外伤引起的自噬、细胞死亡及神经功能障碍的影响，并对其机制进行探讨。　　 方法：采用改良的自由落体装置建立小鼠定量脑外伤(traumatic brain injury，TBI)模型。CBI通过单侧侧脑室在脑外伤前给药，并按伤后时间不同分别于处死前1h用腹腔注射法将碘化丙啶(propidium iodide，PI)注入各组小鼠体内，采用体视学显微镜观察损伤细胞并计数各组损伤及其周边区（皮质与海马）阳性细胞数，研究CBI对TBI引起的神经细胞质膜完整性破坏的影响；为了探讨PI阳性细胞能否代表脑外伤引起的细胞丢失，用组织缺损体积(lesion volume，LV)评估TBI后脑组织损害的情况；采用行为学试验(Motor Test和Morris水迷宫试验)评估TBI后各组动物的运动和学习记忆的情况，以探讨脑外伤引起的细胞丢失能否代表功能的缺失。我们还检测了cathcpsin B活性与表达水平，并应用PI与cathcpsinB，NeuN，GFAP双标进行死亡细胞种类等方面的研究。同时，探讨了cathepsin B对脑外伤后细胞死亡及自噬激活信号途径的作用机制。　　 结果：(1)所有脑外伤组均发现PI阳性细胞，其数量从1小时开始增加，在48h时间点达到高峰。与生理盐水组相比，CBI组均在脑外伤后12，24，48小时显著地降低(P<0.05)。DAPI染色能帮助了解PI阳性细胞的数量。结果显示：与生理盐水组相比，CBI处理显著地减少PI+与DAPI+的比例均在脑外伤后24h与48h(P<0.05)。(2)脑外伤引起的cathepsin B活性增强与表达水平是相关的，对损伤皮质的PI或是cathepsin B阳性细胞进行定量分析，显示大多数被检出的损伤皮质细胞为PI+/cathepsin B+相比之下，在损伤皮质中很难找到PI+/cathepsin B-和PI-/cathepsin B+细胞。CBI处理显著地减少PI+/cathepsin B+细胞的数量。(3) PI与神经元的标志物NcuN重合很高，却很少与GFAP重合。(4) DNA琼脂糖凝胶结果显示有非特异性断裂片段存在，那是由坏死性细胞死亡引起的。凋亡条带也被观察到，表明很强的DNA拖带可能掩盖核内DNA的断裂。(5)脑外伤引起的行为学功能体积缺失与障碍、Bcl-2/Bax蛋白表达水平、Bid切割、细胞色素c释放、caspase-3的激活、LC3及beclin1的表达上调也被检测到；而CBI处理后能逆转这种改变。　　 结论：(1)死亡细胞大多是质膜破坏的神经元，而很少是星型胶质细胞。(2)CBI预防性给药能减少脑外伤引起的细胞死亡、损伤体积、并减轻运动及记忆功能障碍，同时抑制自噬的激活。(3)cathepsin B通过目前的程序性坏死途径、线粒体介导的凋亡途径以及自噬溶酶体途径对脑外伤引起的细胞死亡产生作用。