绿茶多酚EGCG自氧化对其抑癌和细胞毒效应的影响及机制研究

摘要

EGCG主要来源于茶树叶片，是茶叶中含量最丰富的活性物质。绿茶多酚EGCG具有体外抑制癌细胞增殖并杀伤癌细胞的作用，能够剂量依赖和时间依赖地抑制口腔癌细胞Tca8113和结肠癌细胞CT26的增殖，并对两种癌细胞系产生细胞毒作用。其中，30μg/mL的EGCG作用2天时间可抑制Tca811390％的增殖，20μg/mL的EGCG作用3天时间可抑制CT2670%以上的增殖；而50μg/mL的EGCG作用2天时间可杀伤80%的Tca8113细胞，100μg/mL的EGCG作用2天时间可杀伤60%以上的CT26细胞。
　　EGCG抑制癌细胞增殖的作用和对癌细胞的杀伤作用都与氧化还原相关机制有关。EGCG自氧化能够产生大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS），造成细胞氧化逆境。EGCG产生的ROS中至少包括超氧阴离子（Superoxide anion，?O2-）和过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）两种含氧自由基，当EGCG自氧化体系中加入超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）或过氧化氢酶（Catalase，CAT）后，探针可捕捉到的ROS量随之减少。EGCG还具有抑制重要抗氧化酶硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin reductase，TrxR）的活力，以及清除基础抗氧化物质谷胱甘肽（Glutathion，GSH）和半胱氨酸（Cysteine，Cys）的能力。
　　茶叶中存在多酚氧化酶和过氧化物酶，可以在细胞破碎的条件下将EGCG氧化为聚合物，如茶黄素、茶红素等。EGCG在体外的氧化可以通过酶催化或其他条件的设定而实现。37℃水浴条件下，将5mg/mL EGCG溶于pH8.0，200mM的PBS中，以1ml/管的体积分装至12×100mm的玻璃管中，分别进行2h、4h、8h、16h、32h的自氧化，获得一系列EGCG的自氧化产物（EGCG auto-oxidation products，EAOPs）。随着自氧化的进行，溶液颜色肉眼可见地由无色透明逐渐变黄、变红、变深；可见-紫外光谱扫描表明，氧化物在510nm处的吸收逐渐增加，并在250-350nm（EGCG最大吸收波长280nm附近）范围内呈现规律性的变化。HPLC分析表明，在这种条件下EGCG的氧化速度极快：EAOP-2h溶液中只剩余初始EGCG含量的20%，而在EGCG的保留时间附近，出现了一些新的物质峰，但其中并未检测到茶黄素成分。由于EAOP-2h的样品溶液颜色已经为浅棕色，且其后所有的样品中也未检测到茶黄素，因此EAOP-2h氧化程度已经超出茶黄素阶段。自氧化进行4h后，体系中EGCG则完全消失。在278nm HPLC检测条件下，随着EGCG的氧化，EGCG和其周围的峰都逐渐消失，只有在没食子酸（Gallic acid，GA）的保留时间处出现逐渐增高的峰，是一部分EGCG降解的结果。
　　本研究发现，与EGCG相比，EAOP-2h~16h仍然保留与EGCG相似的抑制口腔癌细胞Tca8113和结肠癌细胞CT26增殖及杀伤这两种癌细胞的效应，而EAOP-32h则在两种效应上有所减弱。EGCG的抑癌及抗癌机制与其抑制TrxR活力、产生ROS和H2O2、清除GSH和Cys有关，而EAOPs随着氧化程度的加深，H2O2产生能力逐渐降低，但仍维持与EGCG本身相当的TrxR活力抑制能力和ROS产生能力，同时具有极显著强于EGCG的GSH及Cys清除能力。

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英文缩略词表

1 文献综述

1.1 EGCG

1.2 癌症

1.3 EGCG与癌症

1.4细胞氧化逆境

1.5细胞抗氧化因子

1.6 EGCG氧化产物

2 引言

3 材料与方法

3.1 材料

3.2 方法

4 结果

4.1 EAOPs的制备

4.2 EAOPs在可见及紫外光区的吸收变化

4.3 EAOPs在278nm处的吸收变化——HPLC检测

4.4 EGCG抑制癌细胞增殖的剂量效应和时间效应

4.5 EAOPs对癌细胞增殖的抑制效应

4.6 EGCG杀伤癌细胞的剂量效应和时间效应

4.7 EAOPs对癌细胞的杀伤效应

4.8 EGCG和 EAOPs对游离巯基的清除效应

4.9 EGCG和EAOPs抑制TrxR活力的效应

4.10 EGCG和EAOPs产生ROS的效应

4.11 EGCG和EAOPs产生H2O2的效应

5 讨论与结论

参考文献

致谢

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