粮食中甲基嘧啶磷和镉免疫分析方法研究

摘要

农药和重金属长期以来都是造成粮食安全问题的两种重要污染物，其中农药中的甲基嘧啶磷是一种广泛用在储粮行业的速效仓储害虫杀虫剂，可毒杀多种仓储害虫，同时其对人体也有一定毒性作用，可影响体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，严重时可干扰人体正常新陈代谢。镉是污染最严重的一种重金属，尤其是在大米中。镉通过食物链进入人体并在人体内富集，损伤人体器官，导致严重的慢性疾病。目前粮食中农药和重金属的检测主要依赖于色谱以及色谱与质谱联用、原子吸收光谱等仪器检测法，虽然仪器检测法具有准确度高、精密度好的特点，但是需要昂贵的设备和专业的操作技术人员，检测成本高、时间长、操作比较复杂，无法满足大批量样品的现场快速检测的需求。基于抗原抗体特异性反应的免疫检测技术具有操作简单、耗时短、特异性高、检测成本低的优势，适合高通量快速检测，十分符合我国粮食生产经营分散、量大面广的特点。　　本文以有机磷农药甲基嘧啶磷为研究对象，以其降解产物为目标结构设计半抗原，并合成出相应的完全抗原，制备鼠多克隆抗体，建立了间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫分析方法（ELISA）；以重金属镉为研究对象，合成人工包被抗原，并基于单克隆抗体建立了检测镉的间接竞争化学发光免疫分析方法（CLEIA ）。主要研究内容和结果如下：　　（1）研究制备了针对甲基嘧啶磷的半抗原、人工抗原和特异性抗体　　选取了 9 种甲基嘧啶磷水解产物 [2-（二乙氨基）-6-甲基嘧啶-4-醇，Pr-OH] 的半抗原（Pr-1~Pr-9，其中 5 种为自行设计合成），并分别通过活泼酯法、戊二醛法、重氮化法、N,N-羰基二咪唑法等偶联载体蛋白BSA/OVA获得10种免疫原Pr-1-BSA ~Pr-10-BSA和10种包被原Pr-1-OVA ~ Pr-10-OVA。免疫Balb/c小鼠后定期采集血清进行ELISA分析，结果显示抗血清Pr-9-BSA效果最好，效价为1：32000，对1 μg/mL的Pr-OH抑制率为90%，基于此成功制备了针对甲基嘧啶磷水解产物（Pr-OH）的高特异性多克隆抗体，可用于间接检测甲基嘧啶磷农药。研究分析了免疫原结构与抗血清质量之间的构效关系，对 10 种免疫原的结构进行分子模拟，并结合抗血清质量进行分析，推测嘧啶环的电负性以及偶联方式的选择对抗体的特异性有至关重要的作用。　　（2）建立了间接检测甲基嘧啶磷的间接竞争ELISA方法　　基于所获得的多抗血清，建立了间接检测甲基嘧啶磷的间接竞争ELISA方法，优化了包被原浓度、抗体浓度、反应缓冲体系（缓冲液种类、离子强度、pH）、竞争反应时间、二抗稀释液、二抗稀释倍数、二抗反应时间等参数。所建立的间接竞争ELISA方法检测Pr-OH的检测限（IC10）为3.2 ng/mL，IC50为23.42 ng/mL，线性检测范围（IC20~IC80）为6.09~90.07 ng/mL；所建方法与其余6种结构类似物的交叉反应率均＜0.1%。批内、批间的变异系数均＜15%。大米、小麦样品由甲醇提取、碱性加热条件下水解、PSA净化处理后，通过稀释法消除基质效应。对大米和小麦样品进行添加回收试验，回收率为 71.8%~105.7%，对实际样品的检测结果与 HPLC 法相符。方法特异性强、稳定性好，适用于实际粮食样品的检测。　　（3）建立了检测镉的间接竞争CLEIA方法　　合成了检测镉的人工包被抗原 Cd-ITCBE-OVA ，基于单克隆抗体建立了镉的ic-CLEIA方法。优化了包被原浓度、抗体浓度、反应缓冲体系（缓冲液种类、EDTA含量、离子强度、pH）、竞争反应时间、二抗稀释液、二抗稀释倍数、二抗反应时间等参数。所建立的Cd-CLEIA检测限（IC10）为0.06 ng/mL，IC50为0.50 ng/mL，线性范围（IC20~IC80）为0.16~1.56 ng/mL。与其他12种金属离子及络合剂EDTA的交叉反应率均＜0.3%，批内、批间变异系数均＜15%。选取5种粮食样品（大米、小麦、玉米、糯米、糙米）进行了添加回收试验，样品经稀酸处理后，提取液稀释 30 倍可直接用于测定，添加回收率为79.2%~118.4%，变异系数为6.0%~15.8%，对实际样品的检测结果与GFAAS法相近，线性R2=0.984。方法灵敏度高、特异性强、稳定性好，适用于实际粮食样品的检测。

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