PTPN2通过抑制STAT3磷酸化抑制小鼠胚胎干细胞的自我更新

摘要

在小鼠胚胎干细胞中添加细胞白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor，LIF)能够触发STAT3蛋白上第705位的酪氨酸的磷酸化，此位点的磷酸化可以激活STAT3，促使STAT3进入到细胞核内，从而与它靶基因结合并激活它们的表达，最终维持小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells mESCs）的自我更新状态;此外，很多研究者们也都发现将STAT3及其靶基因过表达后，在添加LIF，CHIR99021和PD0325901的条件下，能够将分离自着床后的小鼠上胚层干细胞(Epiblast stem cells，EpiSCs)诱导重编程回到mESCs状态。STAT3主要在经典通路Janus途径中发挥作用，所以STAT3蛋白第705位的酪氨酸的磷酸化是主要通过Janus激酶途径来实现的。虽然目前关于STAT3基因在mESCs中的功能虽然有很多报道，但与其相互作用的蛋白的却未鉴定出来。 过表达STAT3可以替代LIF的功能，从而维持mESCs在未分化状态，我们的研究发现:在过表达基因STAT3的细胞系中上调PTPN2(protein tyrosine phosphatase non-receptor type2)基因能够诱导mESCs分化。而PTPN2先前报道与STAT3蛋白可能存在相互作用，所以我们推测PTPN2引起的mESCs分化可能是与STAT3有关系。为了确定STAT3与PTPN2在蛋白质水平上是否存在着某种相互作用，从而导致mESCs发生分化，我们在体内和体外进行了以下三个方面的研究: 首先，为了探究STAT3与PTPN2是否存在蛋白间的相互作用，基于蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)技术，我们构建了分别携带HA和FLAG标签的STAT3和PTPN2过表达载体，并导入mESCs，Co-IP结果显示:外源性的STAT3与PTPN2蛋白在蛋白质水平存在相互作用。接着我们利用内源性的STAT3和PTPN2特异性的抗体进行了Co-IP实验，进一步证实了内源性的STAT3和PTPN2在蛋白水平也确实存的相互结合。这一实验结果证实了我们先前的猜想，确定了二者在蛋白水平的关系。 接着，为了明确PTPN2是否可以削弱LIF/STAT3信号通路维持mESCs自我更新的能力，我们在mESCs中过表达了PTPN2，结果显示mESCs发生了分化。蛋白质印迹法检测干细胞自我更新标志基因Esrrb、Klf4和Nanog三个蛋白的含量，结果显示这三个蛋白的表达量降低了。紧接着我们又通过免疫荧光和实时定量qPCR等技术，发现多能性基因的表达在PTPN2存在的情况下的确降低了，而分化相关基因T和Cdx2表达上调。mESCs自我更新主要与STAT3的磷酸化有关，其中705位的酪氨酸又充当着非常重要的角色，而PTPN2是一个去磷酸化蛋白，于是我们检测了STAT3705位酪氨酸的磷酸化水平，结果显示:PTPN2能够降低STAT3705位磷酸化水平。此外我们还发现在LIF的刺激下与PTPN2蛋白结合的磷酸化的STAT3蛋白含量增多了。同时，LIF能够刺激PTPN2从细胞质进入细胞核内。这些结果说明PTPN2蛋白能够与磷酸化的STAT3结合，从而使其去磷酸化，最终阻碍STAT3与自我更新相关基因的启动子结合，致使这些基因不能够被有效诱导表达，最终导致mESCs分化。综上，PTPN2抑制STAT3的活性主要是通过降低STAT3的705位酪氨酸残基去磷酸化，从而导致mESCs的分化。接下来，我们做了反向实验，即利用RNA干扰技术将PTPN2的表达量降低，观察其是否依然影响干细胞的自我更新，结果显示:PTPN2表达量降低能够延缓mESCs分化。为了确定这一结果，我们进一步利用CRISPR/CAS9系统在mESCs中敲除了PTPN2基因，观察到的结果与RNA干扰结果一致。这些实验结果表明:PTPN2的存在抑制了小鼠胚胎干细胞的自我更新能力。 因为STAT3过表达还能够将EpiSCs重编程回到ESCs状态，因此最后我们检测了PTPN2是否会影响STAT3介导的EpiSCs重编程。我们在过表达STAT3的EpiSCs中的细胞株中敲低PTPN2的转录本，结果显示STAT3过表达的EpiSCs里产生了很多mESCs克隆，表明降低PTPN2的活性可以提高STAT3重编程EpiSCs的能力。为了反向确认这个研究结果，我们又在过表达STAT3的EpiSCs中同时过表达PTPN2基因，发现mESCs克隆的生成数量减少了，所以上调PTPN2会抑制STAT3活性，从而导致后者重编程EpiSCs的能力降低。 综上，我们通过一系列实验证明了PTPN2和STAT3在mESCs存在蛋白质相互作用，前者通过抑制STAT3磷酸化从而抑制小鼠胚胎干细胞的自我更新。这些发现丰富和完善了小鼠胚胎干细胞的调控网络，有利于其未来的研究和应用。