miR--29c对TGF--β1刺激的大鼠肾间质成纤维细胞的作用研究

摘要

研究背景： 肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是慢性肾脏病(chronickidney disease，CKD)进展至慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)的共同途径和主要病理基础。其中，肾间质成纤维细胞激活，过度合成并分泌胶原蛋白等细胞外基质，在肾间质纤维化发生发展中起着重要的作用。 研究表明miR-29同脏器纤维化高度相关，它直接抑制靶基因，如胶原蛋白、纤连蛋白等细胞外基质mRNA表达，从而延缓或抑制纤维化。 研究目的： 本研究通过构建TGF-β1刺激大鼠肾间质成纤维细胞过度合成胶原蛋白等细胞外基质的体外模型，观察miR-29c及细胞外基质的表达变化；并进一步干预miR-29c表达水平后，观察细胞外基质的表达变化，探讨miR-29c对TGF-β1刺激的大鼠肾间质成纤维细胞的作用。 方法： 1.应用不同浓度(0 ng/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、2ng/ml、5 ng/ml和10ng/ml)和不同时间(0 h、6h、12h和24h)来寻找TGF-β1刺激大鼠肾间质成纤维(NRK-49F)细胞的合适的浓度和时间点；Real-TimePCR检测细胞外基质胶原Ⅰ(CollagenⅠ，ColⅠ)，胶原Ⅲ(CollagenⅢ，ColⅢ)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA水平，茎环Real-Time PCR检测miR-29c表达变化。Western Bloting检测α-SMA蛋白表达。 2.利用microCosm、miRanda、miRNAMAP及高通量测序预测miR-29c的靶基因，并找出4种方法所预测到靶基因的交集。 3.通过转染miR-29c mimics上调miR-29c表达，Real-Time PCR和WesternBloting检测胶原Ⅰ(CollagenⅠ，ColⅠ)和原肌球蛋白1(tropomyosin1，TPM1)的mRNA和蛋白水平变化。 结果： 1.TGF-β1能刺激大鼠肾间质成纤维细胞过度合成胶原蛋白等细胞外基质：随着TGF-β1浓度的升高及时间的延长，ColⅠ、ColⅢ及α-SMA的mRNA及α-SMA蛋白表达升高。 2.TGF-β1刺激大鼠肾间质成纤维细胞过度合成胶原蛋白等细胞外基质后miR-29c表达变化：随着TGF-β1浓度增加，miR-29c表达逐渐下降(P<0.05)。与对照组相比，2ng/ml TGF-β1刺激NRK-49F细胞0 h、6 h、12 h和24h后，随着时间延长，miR-29c表达下调，差异具有显著性(P<0.05)。 3.上调miR-29c后能下调大鼠肾间质成纤维细胞中Col I和TPM1 mRNA及蛋白的表达量(P<0.05)；随miR-29c浓度逐渐上升，Col I及TPM1 mRNA的表达量逐渐下调。 4.在大鼠肾间质成纤维细胞中上调miR-29c表达量后，再应用2ng/ml TGF-β1刺激细胞24h，胶原蛋白及TPM1表达无明显变化(P>0.05)。 结论： 在TGF-β1诱导NRK-49F细胞纤维化过程中miR-29c表达下降。化学合成的miR-29c模拟物(miR-29c mimics)通过提高miR-29c表达来减少COL I及TPM1的表达量，并通过有效抑制TGF-β1刺激NRK-49F细胞株COL I及TPM1表达起到抗纤维化作用。