TGase发酵工艺优化及其在枯草芽孢杆菌表达研究

摘要

谷氨酰胺转氨酶(transgluaminase，EC2.3.2.13，TGase)是催化蛋白质或多肽间发生共价交联反应的转移酶，可促进蛋白质凝胶化，在食品、医药、化妆品等领域有广泛应用。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶是目前研究的热点，但存在活力低、稳定性差等问题。本文以茂源链霉菌（Streptomyces mobaraenis）为研究对象，优化其发酵产TGase工艺，研究其酶学特性;利用分子生物学技术对S.mobaraenseTGase基因进行改造，获得高酶活性的重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株。主要研究结果如下:　　(1)采用单因素和正交试验，以TGase酶活为主要考察指标，确定S.mobaraense产TGase的优化培养基为(g/L):葡萄糖40，蛋白胨40，硝酸铵1，酵母膏2，MgSO42，K2HPO42。采用单因素和响应面试验，确定S.mobaraense产TGase的优化发酵条件为:初始pH7.0，装液量78mL，转速150r/min，温度30℃，接种量10％(V/V)，培养时间96 h。　　(2)S.mobaraense TGase发酵液经硫酸铵分级盐析、超滤、透析冷冻干燥和凝胶层析等处理后获得纯酶。SDS-PAGE电泳显示为一条单一明显的条带，其相对分子量约为37.2 kD。TGase纯化倍数达5.22倍，比活力为5.73 U/mg，酶回收率为53.97％。TGase最适反应温度为50℃，低于40℃时酶活可保持80％以上，60℃时酶活基本丧失;TGase最适pH为7.0，在pH5.0-9.0的范围内酶活稳定在65％以上，其中在pH8-10碱性条件下酶活缓慢下降，在pH3.0-5.0酸性条件下快速下降。Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、pb2+等离子对酶活有强烈抑制作用，而Ca2+、Mn2+、Na+等离子对酶活性影响小。抗氧化剂还原型谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇(DTT)和乙二胺四乙酸(EDTA)有助于提高TGase酶活，当EDTA浓度为1.0mM时，相对酶活达到最大133％;当GSH和DTT浓度为5.0 mM时，相对酶活分别为137％和128％。　　(3)以S.mobaraense基因组DNA为模板，PCR扩增获得TGase基因，将其与分泌型表达载体pWB980连接，构建重组质粒pWB980-sTGase转化到枯草芽孢杆菌WB600中，实现了异源表达，经纯化和酶原激活后酶蛋白活力可达(3.33±0.21)U/mL，比活力为11.36 U/mg。利用融合PCR定点突变技术分别将TGase氨基酸序列中第199位丝氨酸突变为丙氨酸，N端前3个氨基酸DSD突变为M，构建两株突变菌株B.subtilis WB600/pWB980-smtgM、B.subtilisWB600/pWB980-smtgS199A，经表达、纯化和酶原激活后其活力分别为(7.66±0.25)U/mL和(17.16±0.35)U/mL，比活力为13.38 U/mg和26.27 U/mg。所得三种重组酶蛋白（protein/smtg、protein/smtgM、protein/smtgS199A）比酶活均高于原始菌株纯化后的酶（crude enzyme）。圆二色谱分析显示，表达的重组酶蛋白二级结构与原始的相比发生了变化，前者以α螺旋和β转角为主，后者以α螺旋和β折叠为主。其中，重组酶蛋白β-转角含量较高，特别是protein/smtgS199A，其含量高达77.6％，而原始酶蛋白β-折叠含量较高，为80.8％。

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摘要

第一章 绪论

1．1 谷氨酰胺转氨酶概述

1．1．1 TGase的来源

1．1．2 TGase作用机理

1．1．3 TGase活化机制及空间结构

1．2 TGase在食品中的应用

1．2．1 肉制品

1．2．2 乳制品

1．2．3 豆制品

1．2．4 水产品

1．2．5 面制品

1．3 TGase在其他工业中的应用

1．4 TGase国内外研究进展

1．4．1 发酵法

1．4．2 分离纯化

1．4．3 异源表达

1．5 枯草芽孢杆菌

1．5．1 枯草芽孢杆菌简介

1．5．2 枯草芽孢杆菌表达系统

1．6 课题研究的目的意义及主要内容

1．6．1 立题依据及意义

1．6．2 主要研究内容

1．6．3 论文技术框架路线图

第二章 产TGase发酵培养基及发酵条件优化

2．1 材料与方法

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 仪器与设备

2．1．3 培养基

2．1．4 培养方法

2．1．5 试验方法

2．1．6 分析方法

2．1．7 数据处理

2．2 结果与分析

2．2．1 种子生长曲线及种龄的确定

2．2．2 发酵培养基的优化

2．2．3 发酵条件优化

2．3 本章小结

第三章 TGase分离纯化及酶学性质

3．1 材料与方法

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 仪器与设备

3．1．3 培养方法

3．1．4 分离纯化方法

3．1．5 酶学性质研究方法

3．1．6 分析方法

3．1．7 数据处理

3．2 结果与分析

3．2．1 硫酸铵分级沉淀优化

3．2．2 超滤条件优化

3．2．3 凝胶层析

3．2．4 TGase各步纯化步骤酶活得率

3．2．5 纯化结果及SDS-PAGE电泳鉴定

3．2．6 TGase酶学性质

3．3 本章小结

第四章 TGase基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

4．1 材料与方法

4．1．1 酶与试剂

4．1．2 仪器与设备

4．1．3 菌株和质粒

4．1．4 主要溶液配制及培养基

4．1．5 试验方法

4．1．6 重组TGase性质分析

4．1．7 数据处理

4．2 结果与分析

4．2．1 pro-TGase基因克隆和重组枯草芽孢杆菌的构建

4．2．2 TGase蛋白表达及其纯化

4．2．3 重组TGase蛋白性质测定

4．3 讨论

4．3．1 枯草系统对smtg表达的影响

4．3．2 突变菌株成功表达分析

4．3．3 酶蛋白二级结构差异分析

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

攻读学位期间的学术活动及成果清单