具有协同效应的南极假丝酵母脂肪酶B和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的共展示研究

摘要

表面展示技术是将外源蛋白以融合蛋白的形式展示在微生物表面并保持其原有生物活性的技术,已被广泛应用于全细胞催化剂、抗体制备、生物传感器和疫苗等领域。南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)具有独特的脂肪酶催化特性,本研究采用表面展示技术将这两种脂肪酶共展示在毕赤酵母细胞表面作为全细胞催化剂,酶活力及催化效率均得到较大提高,具有重要意义。目前尚无具有协同效应脂肪酶在毕赤酵母细胞表面共展示的报道。
　　本研究依据生物信息学软件VMD6.0对脂肪酶晶体结构可视化分析结果,首先分别选择几种合适的锚定蛋白与 EGFP和RFP融合,构建基于毕赤酵母pPIC9k和pPICZαA的展示系统,并评价锚定蛋白对荧光蛋白EGFP和RFP的展示效果。然后,分别选择适合于两种表达系统的锚定蛋白,构建毕赤酵母CALB单展示系统和TLL单展示系统。在此基础上,采用二次电转的方法将CALB和TLL共展示在毕赤酵母细胞表面。本论文主要研究工作及结果摘要如下:
　　1.以加强型绿色荧光蛋白(EGFP)为靶蛋白,以Cwp2p、Sed1p、α凝集素为C端锚定蛋白,分别构建基于毕赤酵母pPIC9k表达系统,经筛选各获得1株重组菌。对重组菌发酵细胞进行流式细胞仪分析,结果表明:Cwp2p对EGFP展示率为53.35％;Sed1p对EGFP展示率为99.5％;α凝集素对EGFP的展示率为46.26％。以Sed1p为锚定蛋白,成功构建CALB单展示系统,最终获得1株橄榄油水解酶活为85.5U/g干细胞的CALB单展示重组子。抗体处理后的重组子发酵细胞经免疫荧光检测,结果表明,荧光显微镜下酵母细胞表面呈现明显的绿色荧光,流式细胞仪分析其展示率达98.81％。单展示CALB全细胞催化剂酶学性质如下:最适温度为40℃,pH为8.5,在40℃和60℃条件下1h内分别保持85％和30％酶活力,K2+、Ca2+、Mg2+对该酶有微弱激活作用,Mn2+、Cu2+、EDTA、DMSO、TritonX100、甲醇等对其活力有抑制作用,SDS对活力影响不大。
　　2.以红色荧光蛋白(RFP)为靶蛋白,以N端部分缺失的Flo1p和Sed1p为锚定蛋白,构建基于pPICZαA的毕赤酵母表达系统。将筛选获得的1株展示RFP的重组菌进行流式细胞仪分析,结果表明:Flo1p对RFP展示率为24.66％,Sed1p对RFP展示率为98.36％。以Sed1p为锚定蛋白,成功构建TLL单展示系统,最终获得1株橄榄油水解酶活达257.8 U/g干细胞的展示TLL重组子。免疫荧光检测表明,其发酵细胞在荧光显微镜下呈现明显的红色荧光,流式细胞仪分析其展示率达98.02％。单展示TLL酶学性质如下:其最适底物碳链长度为C4;最适温度为30℃;最适pH为8.0;K2+、Ca2+、Mg2+对展示的TLL存在微弱的激活作用;Mn2+、Ni2+对其有微弱的抑制作用;Cu2+、甲醇、乙醇、异丙醇等对其抑制作用较强,具备良好的热稳定性和有机溶剂稳定性。
　　3.将表达载体pPICZαA-TLS电转化重组菌GS115/pPIC9k-CAS,筛选获得1株橄榄油水解酶活为623U/g干细胞的CALB和TLL共展示重组子,其活力分别比单展示CALB和单展示TLL提高了7.3倍和2.4倍。共展示重组子发酵细胞经抗体处理后进行免疫荧光检测,结果如下:在荧光显微镜下,采用488nm和545nm激发光分别观察到重组酵母细胞表面呈现较强的绿色荧光和红色荧光,流式细胞仪分析其CALB和TLL的展示率分别为94.86％和74.45％。共展示重组子酶学性质如下:最适碳链长度为C4;最适温度为30℃;最适pH为8.5;K2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、EDTA、DMSO、TritonX-100、SDS对共展示细胞存在微弱的激活作用;Ni2+对其有微弱的抑制作用;Cu2+、甲醇、乙醇、异丙醇等对其抑制作用较强,具备良好的热稳定性和有机溶剂稳定性。共展示CALB和TLL重组细胞催化生物柴油得率为72.62％,比单独展示CALB及TLL的重组子分别提高了11.04％和12.62％。

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1 文献综述

1.1 微生物表面展示技术研究进展

1.2 毕赤酵母表达系统

1.3 脂肪酶研究进展

1.4 本研究的目的及意义

2 南极假丝酵母脂肪酶B单展示系统的构建

2.1 材料与方法

2.2 方法

2.3 结果与分析

3 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶单展示系统的构建

3.1 材料

3.3 结果与分析

4 CALB和TLL共展示系统的构建

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 小结与讨论

5 全文总结与展望

5.1 全文总结

5.2 展望

参考文献

致谢

附录1 攻读硕士学位期间发表论文

附录2 脂肪酶基因序列