疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶基因在毕赤酵母中的表面展示

摘要

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)是一种耐热性好、位置特异性和区域选择性较强的脂肪酶,在洗涤剂、化妆品、生物化工等领域有良好的应用前景.但目前商品化的TLL多是固定化酶,在经分离纯化获得游离酶蛋白后还需要固定化,因而价格偏高,限制了广泛应用.本研究将来自疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因经密码子优化后全基因合成,并以毕赤酵母内源壁蛋白Gcw61p为锚定蛋白,构建了pHKA-Tll2-Gcw61展示型重组质粒.该重组质粒经限制性内切酶Pme I线性化后使用电转化到毕赤酵母GS115,经三丁酸甘油酯平板筛选后,获得水解酶活较高的重组毕赤酵母GS115/pHKA-Tll2-Gcw61.摇瓶发酵144h后,菌体酶活最高可达1964.76U/g.发酶液经初步纯化后经真空冷冻干燥,用于该脂肪酶酶学性质的研究.研究发现,重组TLL2其最适底物为对硝基苯酚己酸酯,最适作用温度为55°C,最适作用pH为9.0,在70°C中保存90min,酶活力仍保存70％以上,具有较高耐热的特性.Ca2+、Mn2+、Zn2+对酶有强烈的激活作用,Cu2+、Fe2+、Fe3+、K+、Li+、Na+、Co2+对酶有强烈抑制作用,Ba2+、Mg2+、Ni2+对酶影响不大.