副干酪乳杆菌胞外多糖对酸乳质构形成的影响及其机制研究

摘要

乳酸菌胞外多糖（Lactic Acid Bacteria Exopolysaccharides，LAB EPS）的产生可以显著影响酸乳的质构特性，即用能够分泌胞外多糖的发酵菌株制作发酵乳，很明显发现酸乳的粘稠度、保水性、凝胶性均有所增加，这主要是因为胞外多糖可以与酸乳中的蛋白发生相互作用。因此本论文主要开展了副干酪乳杆菌胞外多糖对发酵乳质构特性及其与乳中蛋白的作用机制研究，主要研究内容及实验结果如下:
　　(1)副干酪乳杆菌胞外多糖与酸乳质构特性的关系:考察了不同发酵条件下胞外多糖的分泌与发酵乳结构形成的关系。单因素试验结果显示，发酵时间、接种量和发酵温度对胞外多糖的产生和质构形成均有明显的影响。响应面分析表明，在发酵时间为8h，接种量为14％，发酵温度为40℃的最适条件下，发酵乳的胞外多糖产量和黏度分别达到1026.4mg/L和1351.9g.sec。此外，发酵乳的黏度与胞外多糖产量呈指数关系。高效液相色谱分析表明，采用副干酪乳杆菌发酵酸乳时，主要胞外多糖EPS1和EPS2可能是发酵乳质构形成所需的。
　　(2)副干酪乳杆菌胞外多糖的分离纯化:将在最优条件下发酵的酸乳经水提、醇沉、脱蛋白后得到粗多糖，经DEAE-Cellulose层析柱分离后得到三种不同组分多糖，分别为水洗糖EPS-W、0.1M盐洗糖EPS-S1和0.2M盐洗糖EPS-S2。其中，EPS-S1进一步采用Sephacryl S-500凝胶柱层析分级纯化得到均一组分多糖EPS-S11，相对分子质量为1.68×107Da，糖醛酸含量为8.26％。单糖组成分析结果表明，EPS-S11是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸构成的，且摩尔比为0.87∶0.92∶1.00∶0.24，甲基化和核磁分析结果表明，其主要由→4)-β-D-Manp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、→4，6)-α-D-Glcp-(1→、α-D-GlcpA-(1→和端基β-D-Glcp-(1→构成。
　　(3)研究了EPS-W、EP S-S1、EPS-S2与酪蛋白酸钠(sodium casein，SC)的混合体系在不同的pH、多糖浓度，以及离子强度(NaCl、CaCl2)下的浊度、粒径和Zeta电位的变化趋势，结果表明，EPS-S1和EPS-S2能够与SC相互作用并形成可溶性复合物，在pH=4的条件下电位最大，说明相互作用最强，而EPS-W则是在pH=5的条件下形成可溶性复合物更多，相互作用最大。EPS的加入以及添加较低浓度的盐离子(＜40mM)，均能抑制SC在等电点附近聚集沉淀，高浓度的离子强度会产生静电屏蔽作用，阻碍EPS与SC之间的相互作用。
　　(4)通过等温量热滴定和激光共聚焦显微镜的方法进一步探究了均一组分EPS-S11与SC之间的相互作用，ITC结果显示，△H=-2.307E5±1.375E4cal/mol，△S=-742cal/mol/deg，分析可得△H＜0，-T△S＞0，|△H|＞|-T△S|,△G=△H-T△S＜0，说明EPS-S11与蛋白之间的结合是一个焓驱动的自发反应过程。同时也显示了EPS-S11在刚加入至SC溶液时，二者之间存在相互作用为疏水相互作用或者相应共价键的结合，之后当EPS-S11的浓度越来越高时，EPS-S11能够解离出更多的负电荷，从而与SC上的正电荷区域发生静电相互作用。微观结构结果显示，EPS-S11的加入能够明显减缓蛋白之间的聚集。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 酸乳稳定机理及乳酸菌简介

1．1．2 乳酸菌简介

1．2 乳酸菌胞外多糖的研究进展

1．2．1 LAB EPS的种类与合成

1．2．2 影响LAB EPS产生的因素

1．2．3 LAB EPS的工艺学功能

1．2．4 LAB EPS的分离纯化及结构

1．3 胞外多糖与蛋白的作用机理研究进展

1．3．1 酪蛋白简介

1．3．2 酪蛋白酸钠简介

1．4．1 研究目的

1．4．2 研究主要内容

1．4．3 研究技术路线如下图

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4．1 接种量、发酵温度对胞外多糖分泌量与酸奶质构的影响

2．4．2 响应面实验分析

2．4．3 副干酪乳杆菌胞外多糖的提取分离纯化

2．4．4 质构特性测定

2．4．5 发酵乳在不同发酵时间下的质构特性以及胞外多糖组分的变化

2．4．6 副干酪乳杆菌胞外多糖的理化性质分析

2．4．7 副干酪乳杆菌胞外多糖的结构解析

2．4．8 副干酪乳杆菌胞外多糖与酪蛋白酸钠的相互作用研究

2．5 统计学分析

第三章 结果与讨论

3．1．1 发酵时间的选择

3．1．2 接种量的选择

3．1．3 发酵温度的选择

3．2 响应面实验结果及分析

3．3 不同发酵时间下胞外多糖的质构特性和含量变化分析

3．4 胞外多糖产量与酸乳黏度的线性拟合

3．6 不同胞外多糖组分EPS-W、EPS-S1、EPS-S2与SC相互作用表征

3．6．1 SC-EPS复合溶液在不同pH条件下的浊度、粒径、Zeta电位的变化

3．6．2 不同EPS浓度对SC浊度、粒径、Zeta电位的影响

3．6．3 离子强度对SC-EPS复合溶液浊度、粒径、Zeta电位的影响

3．7 副干酪乳杆菌胞外多糖均一组分EPS-S11理化性质分析及结构解析

3．7．1 副干酪乳杆菌胞外多糖均一组分EPS-S11理化性质分析

3．7．2 红外光谱分析

3．7．3 单糖组成分析

3．7．4 甲基化分析

3．7．5 核磁共振分析

3．8 副干酪乳杆菌胞外多糖均一组分EPS-S11与SC作用机制分析

3．8．2 等温量热滴定分析

3．8．3 微观结构观测

第四章 结论

参考文献

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况