凡纳滨对虾原肌球蛋白的提取、纯化及一级结构的鉴定

摘要

虾及其制品具有较高的营养价值和独特的风味，越来越受到人们的青睐。但虾是极易致敏的食物之一，严重威胁着人类的健康，因此开展虾的过敏原研究对保护人们生命健康，提高人民生活质量具有巨大的经济效益和社会效益。本论文选用常见的食用虾种，凡纳滨对虾(Litopenaeus Vannamei又称南美白对虾)，作为研究对象，确立了一种快速纯化凡纳滨对虾主要过敏原蛋白原肌球蛋白的方法，并在纯化过程中保留了其过敏原性，为进一步研究虾类过敏原的结构与功能奠定了一定的理论基础。所纯化的蛋白在间接酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测中作为特异性抗原与虾过敏症患者血清中特异性IgE有良好的反应性，也为虾类食物过敏反应疾病的诊断和研制脱敏试剂奠定了良好的基础。
　　首先，以1 mol/L KCl抽提凡纳滨对虾丙酮粉中蛋白质，通过40％饱和度的硫酸铵盐析提取主要过敏原蛋白。利用8例虾过敏患者血清通过免疫印迹(westernbloting，WB)分析，鉴定出凡纳滨对虾盐析样品中有3条特异性过敏蛋白条带，其分子量分别为34kDa、36kDa和68kDa，其中36kDa为主要致敏组分。
　　然后对比研究了使用DE52离子交换柱单柱层析纯化过敏原蛋白和使用DE52阴离子交换柱分别与D152、CM-Sepharose CL-6B阳离子交换柱串联的方法纯化虾过敏蛋白。经比较，DE-52阴离子交换层析柱与D152阳离子交换层析柱串联进行纯化的穿柱峰样品中，主要过敏原蛋白含量最高。纯化的提取工艺条件为:DEAE-52阴离子交换层析柱pH3.4，D152阳离子交换层析柱pH5.8，上样量为7.14mg/mL柱体积。HPLC分析主要过敏原蛋白的相对含量可达95％以上。免疫印迹和间接酶联免疫对已经纯化的虾过敏蛋白进行了分析和鉴定，免疫印迹反应率达100％，酶联免疫OD492最高达0.6050。
　　纯化的凡纳滨对虾主要过敏原通过MALDI-TOF-MS鉴定，确定为原肌球蛋白，得到其一级结构序列如下:MDAIKKKMQAMKLEKDNAMDKADTLEQQNKEANNRAEKAEEEVHGLQKRMQQLENDLDQVQESLLKANTQLEDKDKALSNAEGEVAALNRRIQLLEEDLERSEERLNTATTKLAEASQAADESERMRKVLENRSLSDEERMDALENQLKEARFLAEEADRKYDEVARKLAMVEADLERAEERAETGESKIVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEKANQREEAYKEQIKTLANKLKAAEARAEFAERSVQKLQKEVDRLEDELVNEKEKYKSITDELDQTFSELSGY
　　凡纳滨对虾原肌球蛋白分子中芳香族氨基酸占2.5％，脂肪族氨基酸占30.9％。其中含量较高的氨基酸是丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)和亮氨酸(Leu)，均超过了10％序列中缺少半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)和色氨酸(Trp)。该多肽不含有半胱氨酸Cys，这也就说明凡纳滨对虾主要过敏原分子内部不能形成二硫键(S-S)。该序列与虾蟹具有较高的同源性，与虾的同源性最高可达98％。这表明物种之间亲缘关系近，蛋白质序列一致性较高。利用生物信息学方法预测了原肌球蛋白可能存在的线性抗原表位有13个，分别为:5-7，13-16，20-42，47-60，69-77，97-107，119-126,132-140,146-149,157-164,177-186,210-224,262-270。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 虾原肌球蛋白的结构与功能

1．1．1 原肌球蛋白

1．1．2 原肌球蛋白一级结构

1．1．3 原肌球蛋白的功能

1．2 原肌球蛋白过敏原的研究进展

1．2．1 原肌球蛋白的提取纯化

1．2．2 原肌球蛋白的免疫活性

1．2．3 过敏原检测方法

1．2．4 原肌球蛋白一级结构测定方法

1．3 课题研究的目的及意义

1．4 本课题研究的主要内容和技术路线

第二章 原肌球蛋白的提取

2．1 引言

2．2 实验试剂及仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 虾纤维蛋白丙酮粉的制备

2．3．2 过敏原蛋白的抽提

2．3．3 过敏原蛋白浓度的测定

2．3．4 硫酸铵盐析饱和度范围确定

2．3．5 凝胶电泳分析(SDS—PAGE)

2．3．6 有效范围内盐析条件筛选

2．3．7 Westen-Blotting鉴定主要过敏原

2．3．8 间接酶联免疫

2．4 结果与分析

2．4．3 饱和度为30％-90％硫酸铵盐析结果

2．4．4 不同盐析条件的结果

2．4．5 酶联免疫结果及Westem Blotting鉴定主要过敏原

2．5 本章小结

第三章 原肌球蛋白的纯化

3．1 引言

3．2 实验试剂及仪器

3．3 实验方法

3．3．2 串联色谱柱纯化原肌球蛋白

3．3．3 酶联免疫检测

3．3．4 Western Blotting分析

3．4．1 单柱DE-52纯化原肌球蛋白结果

3．4．2 串联色谱柱纯化原肌球蛋白结果

3．4．3．串联色谱柱纯化原肌球蛋白western-blotting结果

3．4．4 纯化过程中原肌球蛋白酶联免疫结果

3．4．5 不同pH缓冲液对原肌球蛋白的影响结果

3．5 本章小结

第四章 原肌球蛋白一级结构的鉴定

4．1 引言

4．2 实验方法

4．2．1 蛋白质胶点鉴定

4．2．2 蛋白质胶内酶解

4．2．3 MALDI-TOF／TOF上机

4．2．4 质谱参数选择

4．2．6 氨基酸序列分析

4．3 结果与分析

4．3．1 原肌球蛋白的MALDI-TOF-TOF鉴定

4．3．2 同源性比较

4．3．3 原肌球蛋白氨基酸序列分析

4．6 本章小结

第五章 总结与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

发表论文及参加科研情况说明

致谢