克氏原螯虾主要变应原原肌球蛋白的一个片段区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

摘要

克隆克氏原螯虾主要过敏原原肌球蛋白的一个片段区基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫原性.提取克氏原螯虾总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆得到目的基因;将目的基因连入pMD19-T载体,提质粒酶切鉴定并测序;将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;利用Western-blotting和ELISA检测该重组蛋白的免疫原性.克隆获得目的基因,其片段长为291 bp,编码97个氨基酸.重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western-blotting和ELISA结果表明该蛋白与克氏原螯虾过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性.