BRMS1在骨肉瘤组织中的表达及其抑制骨肉瘤远处转移机制的实验研究

摘要

第一部分：肿瘤转移抑制基因BRMS1在骨肉瘤组织和正常组织中的差异表达以及其意义。 目的:检测BRMSl基因在骨肉瘤组织和正常瘤旁组织中的差异表达以及其在不同转移情况的肿瘤组织中的表达情况以明确其与骨肉瘤生成及转移的关系，为进一步研究BRMSl与骨肉瘤转移潜能之间的关系和作用机制提供理论基础。 方法:用半定量逆转录聚合酶链反应检测手术时收集的70例骨肉瘤患者瘤组织、瘤旁正常肌肉组织以及15例骨巨细胞瘤组织中BRMSlRNA的表达，70例骨肉瘤组织中手术时有10例发现已经发生转移，其余60例手术时未发现转移，同时将这两组患者进行对比，将B．actin条带的光密度值定为10，取：BRMS-1基因条带与β-actin条带光密度值的比值作为目的基因的相对值。 结果:BRMS1mRNA在骨肉瘤组织中的表达水平为0.378±0.046，瘤旁肌肉组织中为0.918±0.044，在骨肉瘤组织中的表达水平明显低于瘤旁正常肌肉组织中的表达。其差异具有统计学意义(P<0.05)。10例发现已经发生转移的患者的平均表达水平为0.456±0.125，60例手术时未发现转移患者的平均表达水平为0.302±0.235。这两组的差异具有统计学意义(P<0.05)。骨巨细胞瘤组的表达平均为0.718±0.045，其同骨肉瘤组相比具有统计学差异(P<0.05)，同正常瘤旁组织的表达水平相比不具有统计学差异。 结论:BRMS1基因在骨肉瘤中低表达，正常肌肉组织和骨巨细胞瘤表达高于骨肉瘤的表达，其与骨肉瘤转移有相关联系，其在抑制骨肉瘤生长及转移过程中可能起着重要作用，可以作为转移能力的预测指标及骨肉瘤治疗很有希望的新方向。 第二部分BRMsl真核表达载体质粒的构建。 目的:利用BRMSl基因片断和质粒pcDNA3.1/myc-His(+)A构建重组pcDNA3.1/myc-BRMSl真核表达载体质粒，为研究BRMSl与骨肉瘤发生及肿瘤远处转移的关系做准备。 方法:从正常肌肉组织标本中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成cDNA。设计引物调取目的基因片段，引物中含有HindIII以及xho I两个酶切位点，将目的基因双酶切后与同样双酶切的pcDNA3.1/myc-His(+)A定向插入，经过T4DNA的作用得到连接体，将上述连接体与T载体连接后转化感受态大肠杆菌DH.5α，筛选阳性菌落并抽提质粒。对重组质粒进行双酶切和测序，测序正确后得到重组质粒pcDNA3.1/myc-BRMSl。然后用pcDNA3.1/myc-BRMSl转染人HEK-293细胞，应用RT-PCR法和Western blot等法来鉴定重组质粒在其中各个层次水平的表达。 结果:经酶切鉴定，证实重组质粒pcDNA3.1/myc-BRMSl含有目的基因BRMSl。酶切后进行琼脂糖电泳显示5．4Kb以及750bp两个片断，5.4Kb片断是pcDNA3.1/myc-His(+)A而750bp片断为目的基因BRMSl，经过测序鉴定其中含有目的基因的全部CDS序列，RT-PCR和Westem blot检测表明，在mRNA和蛋白水平，转染细胞BRMSl的表达均明显增强，证实pcDNA3.1/myc-BRMSl构建成功并且可以在相关细胞中进行表达。 结论:成功构建pcDNA3.1/myc-BRMSl后其在被转染肿瘤细胞中可高表达目的基因，从而将目的基因成功地导入到相关细胞中，对所研究细胞的各种生物学特性产生改变，pcDNA3.1/myc-BRMSl的成功构建为进一步研究BRMSl在骨肉瘤发生及远处转移中的潜在作用奠定了理论和实验基础。 第三部分BRMsl真核表达载体质粒转染MG-63骨肉瘤细胞以及转染后细胞的相关特性鉴定。 目的:利用构建的目的基因BRMSl真核表达载体质粒转染骨肉瘤细胞MG-63，并进一步对转染成功的MG-63骨肉瘤细胞进行相关的生物学特性鉴定，以研究目的基因的致瘤性以及对骨肉瘤细胞转移侵袭能力的影响。 方法:以liposome作为介质对生长良好的MG-63骨肉瘤细胞进行pcDNA3.1/myc-BRMS1转染。对照组用pcDNA3.1/myc-His(+)A进行转染；用G418进行筛选阳性克隆，倒置相差显微镜观察转染后各组细胞大体形态的变化；扫描电镜观察细胞表面超微结构的改变；并行RT-PCR检测转染前后细胞中BRMS1mRNA的表达；MTT法检测细胞的增殖活性；流式细胞仪检测转染前后细胞周期和细胞凋亡的改变；MTT法检测细胞与细胞外基质的黏附能力，改良的Boyden小室检测细胞体外侵袭力的变化以及细胞运动能力的变化；划痕标记荧光染料示踪技术检测细胞间隙连接通讯的变化。 结果:经过pcDNA3.1/myc-BRMS1转染的骨肉瘤细胞同转染空载体质粒pcDNA3.1/myc-His(+)A的骨肉瘤细胞相比其细胞形态在光镜下没有明显变化，在扫描电镜下可以观察到细胞表面的超微结构发生了明显的改变，包括其微绒毛缩短，丝状伪足减少等，同时转染组和未转染组细胞的细胞周期和细胞的凋亡率没有明显的差别(P>0.05)，两组细胞的增殖活性亦没有明显改变，但是转染pcDNA3.1/myc-BRMS1后骨肉瘤细胞的体外侵袭能力下降，转染组细胞穿过人工基底膜的侵袭数量为25.41±3.36，未转染组骨肉瘤细胞以及转染空载体组侵袭细胞数量分别为65.06±0.06以及60.35±3.65；转染.BRMSl基因后，MG-63穿过聚碳酸脂微孔滤膜的细胞数为29.35±3.56，与空载体组63.01±3.26以及未转染组61.35±3.69均有显著性差异(P<0.05)；转染目的基因后细胞间隙连接通讯恢复，而转染空载体组以及未转染组的骨肉瘤细胞的间隙连接通讯缺失，未能通过划痕的细胞向相邻的细胞传递。 结论:MG-63骨肉瘤细胞在转染pcDNA3.1/myc-BRMS1后其细胞中BRMS1mRNA表达增加明显，骨肉瘤细胞的转移潜能明显下降，与此相对应的是其细胞的超微结构发生一系列的改变，细胞末端微绒毛缩短，丝状伪足减少。这可能是改变细胞侵袭转移能力的原因，转染BRMS1基因后可以降低细胞的体外侵袭能力，从而进一步降低细胞的运动能力，细胞间隙连接通讯的恢复亦是重要原因之一。同时空载体质粒pcDNA3.1/myc-His(+)A转染后对骨肉瘤细胞的相应生物学特性没有显著影响。 第四部分：BRMS1转染MG-63细胞和转染后MG-63细胞致瘤性及转移能力的动物实验。 侵袭目的:通过建立骨肉瘤的自发性和实验性转移动物模型，研究BRMS1基因抑制骨肉瘤远处转移的作用和机制，以及其对于骨肉瘤原位生长的影响，进一步证实目的基因抑制肿瘤转移的作用。 方法:将MG-63细胞用连接质粒pcDNA3.1/myc-BRMS1、空载体质粒pcDNA3.1/myc-His(+)A分别进行转染，经过G418筛选后获得阳性克隆。将细胞消化后制成细胞悬液分别制成转染组、空载体组以及未转染组。将随机分组的三组裸鼠分别经尾静脉接种三组细胞建立骨肉瘤的实验性转移动物模型，将随机分组的三组裸鼠分别于胫骨皮下接种三组细胞建立骨肉瘤的自发性转移动物模型。SPF级饲养裸鼠，观察其生长情况。测量裸鼠的体重，测量肿瘤的平均直径，5周后脱颈处死裸鼠常规解剖，取出裸鼠的双肺、肝脏组织漂洗后甲醛固定，观察器官表面的情况，同时进行石蜡包埋，HE染色，进行组织病理学观察，总结肿瘤的具体转移情况。 结果:自发性转移模型裸鼠的体重及肿瘤的平均直径各组均无明显差异(P>0.05)，结果表明BRMS1基因对骨肉瘤在裸鼠胫骨皮下处成瘤性无明显影响，实验性肺转移率和肝脏转移率存在显著性差异(P<0.05)，在转移灶数目方面也存在明显差异(P<0.05)，转染组的转移率明显降低。 结论:自发性和实验性转移动物模型实验进一步证实了BRMS1基因对骨肉瘤本身的生长没有影响，但是其能够显著降低骨肉瘤的远处转移能力。可以显著降低骨肉瘤的远处转移潜能，抑制骨肉瘤的远处转移，BRMS1不但可以作为骨肉瘤预后的指标而且对于骨肉瘤的基因治疗具有十分重要的意义。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

符号说明

课题设计流程图

第一部分：肿瘤转移抑制基因BRMS1在骨肉瘤组织和正常组织中的差异表达及意义

前 言

一实验标本和相关试剂、器械

二方法

结 果

讨论

结 论

附图

参考文献

第二部分：目的基因真核表达载体质粒的构建

前 言

1.材料：

2方法

3结果:

讨论

结论

附图

参考文献

第三部分:目的基因真核表达载体质粒转染MG-63骨肉瘤细胞以及转染后细胞的相关特性鉴定

前 言

一、材料

二实验方法

结 果

讨论

小结和展望

结论

附图

参考文献

第四部分：BRMS1转染后MG-63细胞和转染后细胞致瘤性及转移能力的裸鼠动物实验

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

结论

附图

参考文献

致 谢

攻读博士学位期间发表的文章（第一作者）

心得体会

发表论文一

发表论文二