高直链淀粉转基因水稻和不同糯稻品种稻米的淀粉结构及其功能特性研究

摘要

直链淀粉含量的高低是决定稻米品质及其用途的重要因素。通过对水稻胚乳中淀粉合成相关基因表达的调控，可改变稻米中的直链淀粉含量，进而选育优质或特用水稻新品种。为培育具高直链淀粉、高抗性淀粉含量的水稻新品种，本实验室在前期研究中构建了可同时抑制淀粉分支酶Ⅰ(SBEⅠ，或SBE1)和淀粉分支酶Ⅱ b(SBEⅡb，或SBE3)表达的双反义表达载体，通过农杆菌介导将双反义Sbe基因导入了籼稻品种特青中。本研究的主要内容即是在此基础上，选育了含目的转基因、具有高直链淀粉与抗性淀粉含量的稳定转基因水稻新品系；采用现代仪器分析等技术，较为详细地研究了高直链淀粉转基因水稻中淀粉的理化特性、精细结构及其营养功能特性。除直链淀粉外，支链淀粉的结构也是影响稻米食味的另一重要因素。本研究还以3个具有不同食味品质和粘滞特性的糯稻品种为材料，研究了不同处理对稻米粘滞性的影响，以期进一步探讨米粉粘滞特性与淀粉粘滞特性之间的关系。同时，还分别测定了3个糯稻淀粉的精细结构，为揭示稻
　　 米粘滞特性与淀粉精细结构间的关系提供依据。主要研究结果如下：
　　 1、高直链淀粉转基因水稻新品系的选育与分子鉴定。利用已获得的特青来源的转双反义Sbe基因材料，经PCR筛选鉴定，从其自交后代中选育到了多个纯合转基因系。分子鉴定结果显示，多数转基因水稻植株中整合有1～3个拷贝外源基因；转基因纯合系胚乳中SBE1和SBE3的表达量均明显低于未转化对照，而淀粉粒结合淀粉合成酶(GBSS)的表达不受影响；转双反义Sbe基因种子表观直链淀粉含量较未转化对照有明显的提高，用碘染色法测得最高的达45％左右，比未转化对照(22％)提高了一倍以上；导入双反义Sbe基因所引起的高直链淀粉含量性状能在转基因水稻中稳定传递。
　　 2、高直链淀粉转基因稻米的淀粉组成与结构特性。以选育的2个高直链淀粉含量转基因水稻新品系及其未转化对照为对象，从籽粒形态、淀粉形态、组成、晶体特性、粘性等理化特性、以及淀粉精细结构等方面比较转基因稻米与其亲本间的差异。研究结果表明，转基因水稻种子中两个内源分支酶表达受抑制和表观直链淀粉含量提高后：(1)抗性淀粉含量极显著增加，与未转化对照相比，平均增幅为14.5倍，蛋白质含量等其它组分也有不同程度的改变，但变幅不大；(2)转基因籽粒表现皱缩、糙米外观发黄、垩白增大、粒重下降；(3)籽粒发育过程中，转基因稻米及其对照胚乳干重增殖均呈“S”型曲线变化，花后第8天为转基因稻米及其对照粒重产生差异的一个重要转折点；(4)转基因水稻籽粒内部空隙增多，淀粉粒形态不规则、多数呈圆形和卵圆形，淀粉粒间排布不紧密；(5)转基因稻米淀粉的晶体类型仍然表现为与亲本一致的A型，但结晶度降低；(6)转基因稻米淀粉中含有较多的中长链；(7)转基因稻米的抗溶解和抗糊化特性明显增强。
　　 3、高直链淀粉转基因稻米的功能特性。通过体内和体外两种方法分析高抗性淀粉稻米的营养功能特性，结果显示：(1)转基因稻米淀粉和米粉中的总纤维含量分别为9.30％和15.21％，相比较对照分别增加了1.2倍和4.5倍，达到极显著水平；(2)转基因稻米粉及其纯化淀粉中的慢速消化淀粉组分极显著下降，而快速消化淀粉组分和抗性淀粉组分极显著上升；(3)与饲喂未转化对照大米相比较，进食高直链淀粉转基因稻米饲料的大鼠，其体重增长较慢，排泄物短链脂肪酸含量极显著提高，粪便的pH值减低、粪便排泄量增加。
　　 4、具不同粘滞特性糯稻品种淀粉精细结构和理化特性的比较。以3个具有不同食味品质和粘滞特性的糯稻品种(扬辐糯4号、广陵香糯和苏御糯)为试材，借助淀粉粘度测定仪、差示扫描量热仪和凝胶色谱仪等，详细比较了3个糯稻米粉及其纯化淀粉的淀粉精细结构和理化特性，研究结果显示：(1)3个糯稻品种米粉的粘滞特性有很大差异，峰值粘度表现为：扬辐糯4号＞广陵香糯＞苏御糯；(2)α-淀粉酶活性对米粉的峰值粘度具有抑制作用，而蛋白中的二硫键形成的网状结构对于米粉的峰值粘度具有促进作用；糯稻米粉中的蛋白质结构和α-淀粉酶活性的差异是致使其米粉和淀粉粘滞特性之间产生差异的主要原因；(3)扬辐糯4号淀粉具有较多的A+B1链、较长的平均链长和外侧链长，容易致其表现较高的粘滞度和糊化温度，并容易回生。

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第一章文献综述：植物淀粉品质及其遗传改良

引言

1.1淀粉的组成与结构

1.1.1直链淀粉的分子结构

1.1.2支链淀粉的分子结构

1.1.3淀粉粒的结构

1.2淀粉的理化表现及功能特性

1.2.1淀粉的理化表现

1.2.2淀粉的功能特性及应用

1.3抗性淀粉及其营养功能

1.3.1抗性淀粉的发现、定义及含量

1.3.2抗性淀粉的理化性质

1.3.3抗性淀粉的分类

1.3.4抗性淀粉的生理功能

1.3.5抗性淀粉的应用

1.4稻米淀粉的生物合成及其遗传控制

1.4.1稻米直链淀粉合成的遗传控制

1.4.2稻米支链淀粉合成的遗传控制

1.5植物淀粉品质改良研究进展

1.5.1直链淀粉遗传改良研究进展

1.5.2抗性淀粉开发研究进展

1.6本研究的目的和意义

第二章高直链淀粉转基因水稻的选育与分子鉴定

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1供试水稻材料

2.2.2水稻总DNA的PCR分析

2.2.3 Southern杂交分析

2.2.4半定量RT-PCR分析

2.2.5 Western杂交分析

2.2.6 GBSS表达分析

2.2.7直链淀粉含量的测定

2.2.8田间性状调查

2.3结果与分析

2.3.1纯合转基因水稻株系的选育

2.3.2转基因水稻成熟种子中的直链淀粉含量

2.3.3转基因水稻中双反义Sbe基因的整合

2.3.4转基因水稻中内源Sbe基因的表达

2.3.5转基因水稻种子中GBSS的表达量

2.3.6转基因水稻纯合系的田间表现

2.3.7转基因水稻的遗传稳定性

2.4小结与讨论

2.4.1研究小结

2.4.2不同反义Sbe基因对提高转基因稻米直链淀粉含量效果的比较

2.4.3双反义Sbe基因在转基因水稻中的遗传稳定性

第三章高直链淀粉转基因水稻淀粉的组成与结构

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1供试材料

3.2.2稻米籽粒外观与形态检测

3.2.3颖果发育观察

3.2.4样品制备与处理

3.2.5淀粉的提取

3.2.6直链淀粉含量的测定

3.2.7抗性淀粉含量的测定

3.2.8稻米其他成分分析

3.2.9 X-射线衍射分析

3.2.10扫描电镜观察

3.2.11稻米糊化特性的测定

3.2.12凝胶渗透色谱分析

3.3结果与分析

3.3.1转基因稻米的组成成分分析

3.3.2转基因稻米籽粒的发育与外观品质

3.3.3转基因稻米淀粉粒的结构

3.3.4转基因稻米的糊化特性

3.3.5转基因稻米淀粉精细结构的初步分析

3.4小结与讨论

3.4.1研究小结

3.4.2转基因稻米中淀粉组成的变化

3.4.3转基因稻米粒重下降的可能原因

3.4.4转基因稻米淀粉的分子精细结构

3.4.5转基因稻米淀粉的晶体类型

3.4.6转基因稻米的抗糊化特性

第四章高直链淀粉转基因稻米的功能特性研究

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1供试材料

4.2.2样品制备与处理

4.2.3水稻淀粉的提取

4.2.4稻米淀粉消化特性的测定

4.2.5膳食纤维含量的测定

4.2.6饲料制备

4.2.7动物饲喂与管理

4.2.8检测指标与方法

4.3结果与分析

4.3.1高直链淀粉稻米的体外消化特性

4.3.2饲喂HA2稻米对大鼠摄食量与体重的影响

4.3.3饲喂HA2稻米对大鼠内脏器官重及盲肠长度的影响

4.3.4饲喂HA2稻米对大鼠血生化指标的影响

4.3.5饲喂HA2稻米对大鼠酵解产物生成的影响

4.3.6饲喂HA2稻米对大鼠排便量及其PH值的影响

4.4小结与讨论

4.4.1研究小结

4.4.2高直链淀粉转基因稻米的功能性成分

4.4.3高直链淀粉转基因稻米的生理功能特性

第五章具不同粘滞特性糯稻品种淀粉精细结构和理化特性的比较

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1供试材料

5.2.2样品制备与处理

5.2.3稻米籽粒外观比较

5.2.4淀粉的提取

5.2.5凝胶渗透色谱分析

5.2.6淀粉链长分布分析

5.2.7直链淀粉含量测定

5.2.8总淀粉含量的测定

5.2.9粗蛋白含量的测定

5.2.10水分的测定

5.2.11灰分的测定

5.2.12淀粉中磷含量的测定

5.2.13粘滞性谱分析

5.2.14差示扫描量热仪分析

5.3结果与分析

5.3.1 3个糯稻米粒外观比较

5.3.2 3个糯稻米粉和淀粉的组成分析

5.3.3 3个糯稻米粉的粘滞特性

5.3.4不同处理对3个糯稻粘滞特性的影响

5.3.5 3个糯稻米糊化和回生特性的比较

5.3.6 3个糯稻淀粉分子结构的比较

5.4小结与讨论

5.4.1研究小结

5.4.2 α-淀粉酶、蛋白质和磷对糯稻米粉和淀粉RVA特征谱的影响

5.4.3糯稻米粉RVA特征谱与淀粉RVA特征谱间的关系

5.4.4糯稻淀粉的精细结构对稻米热特性的影响

参考文献

致谢

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