IGF-Ⅰ及CTGF对人肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质合成效应的体外研究

摘要

肾小管间质纤维化是多种慢性进展性肾脏疾病发展为终末期肾功能衰竭的共同通路。肾小管上皮细胞转分化(EMT)作为一种重要的肾间质纤维化的发病机制，已得到人们广泛的关注。生长因子作为内源性信号蛋白对细胞的增生、分化及功能具有强烈的调节作用。他们与细胞表面高亲和性受体结合后，启动了多种信号传导过程，最终诱发新基因表达和蛋白质合成。近年来生长因子在肾小管间质纤维化发病的作用也越来越受到重视，主要包括转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)等。在先前的研究中，我们已经初步证实CTGF可能作为一种有力的促纤维化的因子在人肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质合成方面起一定的作用，为了加深对CTGF在人肾小管间质纤维化方面作用的了解，我们对先前的研究作了进一步的深入。同时最近的研究已经证实CTGF和IGF-Ⅰ作为相互促进的生长因子在肾小管间质纤维化中起重要作用，但是对其机制了解甚少。CTGF和IGF-Ⅰ是否在EMT中起协同作用引起了我们的关注。因此我们选择IGF-Ⅰ与EMT的关系研究作为本实验的一部分，期望其能为CTGF和IGF-Ⅰ在EMT中相互作用的研究作铺垫。 第一部分胰岛素样生长因子-Ⅰ对人肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质合成的影响 目的：探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)在人肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质合成中的作用。 方法：将体外培养的人肾小管上皮细胞(HK<,2>)分为2组： (1)对照组； (2)IGF-Ⅰ组：培养液中加入IGF-Ⅰ，终浓度分别为25、50、100、200ng/ml。倒置显微镜观察细胞形态变化。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定HK<,2>细胞E-钙粘蛋白(E-cadherin)、角蛋白(Keratin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白(FN)、胶原Ⅰα和胶原Ⅲα mRNA水平的变化。ELISA方法检测培养上清中胶原Ⅰ的浓度。 结果：IGF-Ⅰ刺激使HK<,2>细胞形态由椭圆变为梭形。不同浓度的IGF-Ⅰ作用于HK<,2>细胞48h后E-cadherin和Keratin mRNA的表达显著下降(P<0.05)，α-SMA、Vimentin和FN mRNA水平显著升高(P<0.01)，且呈剂量依赖性。不同浓度的IGF-Ⅰ作用于HK<,2>细胞48 h后，胶原Ⅰα和胶原Ⅲα mRNA水平显著升高(P<0.05)；ELISA结果显示，100及200ng/mL IGF-Ⅰ组中HK<,2>细胞分泌的胶原Ⅰ显著增加(P<0.05)。 结论： (1)外源性IGF-Ⅰ在体外能刺激人肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化。 (2)外源性IGF-Ⅰ在体外能刺激人肾小管上皮细胞合成细胞外基质。 第二部分结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质合成的影响 目的：探讨外源性结缔组织生长因子(CTGF)在人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成中的作用。 方法：将体外培养的人肾小管上皮细胞HK<,2>分为3组：(1)对照组；(2)CTGF小剂量组(终浓度为2.5ng/ml)；(3)CTGF大剂量组(终浓度为20ng/ml)。用倒置显微镜观察细胞形态变化，噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性，RT-PCR检测HK<,2>细胞E-钙粘蛋白(E-cadher in)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(FN)和胶原Ⅰα mRNA水平的变化，免疫组织化学方法观察HK<,2>细胞FN和胶原Ⅰ的表达。 结果：CTGF刺激使HK<,2>细胞由椭圆形变为梭形，同时促进HK<,2>细胞增殖。不同浓度的CTGF作用于HK<,2>细胞48 h后，α-SMA和FN mRNA水平显著升高(P<0.05)，E-钙粘蛋白mRNA的表达显著下降(P<0.05)；大剂量CTGF刺激HK<,2>细胞48 h后胶原ⅠαmRNA水平显著升高(P<0.05)。小剂量CTGF组HK<,2>细胞胞浆FN表达水平显著增加(P<0.05)，大剂量CTGF组HK<,2>细胞胞浆表达FN和胶原Ⅰ均显著增加(P<0.05)。 结论： (1)外源性CTGF在体外能够诱导人肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化。 (2)外源性CTGF在体外能够促进人肾小管上皮细胞纤维连接蛋白的合成，大剂量时可以增加其胶原Ⅰ的合成。

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论文说明：缩略语

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前 言

第一部分胰岛素样生长因子-1对人肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质合成的影响

第二部分结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质合成的影响

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