鸭IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法

摘要

本发明公开了一种鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法，包括盒体(1)和隔离垫(2)，还包括IGF-I基因嵌合特异上下游引物(3)、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物(4)、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物(5)、IGF-I基因内对照DNA(6)、IGF-I R基因内对照DNA(7)Tag酶DNA连接酶(8)。本发明将设计独特、稳定和高效的试剂盒与MCF-PCR技术结合，是一种可靠、便捷、价格低廉的检测方法。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法。 

背景技术

我国是世界上最大的水禽生产国和消费国，但是我国水禽业整体生产水平不高，竞争力不强，水禽领域的技术很薄弱、可供利用的科学研究成果很少，特别是有关鸭肌肉生长发育分子技术方面的研究成果极少，因此，要想在短期内快速有效地提高我国鸭业生产水平，就必须借助先进的分子生物学的技术和成果，加快我国鸭业的发展。 

MCF-PCR技术是一种经济、较高通量、准确的多基因表达分析技术，该技术基于竞争性PCR原理，结合荧光通用引物和多重嵌合特异引物使用，实现多重PCR扩增以及毛细管电泳长度差异片段分离，对多个目标基因及参照基因进行同时定量，最后以参照基因校正即可获取目标基因的相对表达量。目前已经广泛应用于人类和动物基因表达检测研究。国内外大量的研究报道，IGF-I和IGF-I R基因在鸭生长发育调控过程中起重要作用。IGF-I和IGF-1R基因在组织中表达量的准确分析对IGF-I和IGF-I R基因的功能揭示和应用都有显著的科学和现实意义。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法，将设计独特、稳定和高效的试剂盒与MCF-PCR技术结合，是一种可靠、便捷、价格低廉的检测方法。 

其具体技术方案为： 

一种鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒，包括盒体和隔离垫，还包括IGF-I基因嵌合特异上下游引物、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物、IGF-I基因内对照DNA、IGF-I R基因内对照DNA、Tag酶DNA连接酶。 

一种本发明所述的鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法，其特征在于，包括以下步骤： 

1)引物设计 

通用引物的设计： 

设计原则保证上下游引物的TM值≤58℃，为了避免通用引物带来非特异产物，通用引物的长度为18bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记； 

嵌合特异引物的设计： 

根据GenBank数据库中目标基因IGF-I和IGF-I R及参照基因ACTB基因的cDNA序列信息，设计了3对20～26bp长的序列作为嵌合特异引物，TM值≥61℃，扩增产物长度在200～310bp之间，相邻产物长度的差大于10bp，之后与通用引物组成嵌合特异引物，且在通用引物的3’端插入ct两个碱基，引物经Blast和Oligo mask软件分析，确保特异性扩增； 

IGF-I基因嵌合特异上下游引物P1和P2、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物P3和P4、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物P5和P6，P1～P6六条引物详细信息如下，每条引物中小写ct前是通用引物，小写ct后为特异引物： 

IGF-I基因嵌合特异上游引物P1表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’ 

IGF-I基因嵌合特异下游引物P2表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3’ 

IGF-I R基因嵌合特异上游引物P3表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’ 

IGF-I R基因嵌合特异下游引物P4表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3’ 

参照基因ACTB嵌合特异上游引物P5表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’ 

参照基因ACTB嵌合特异下游引物P6表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3’； 

2)合成内对照DNA片段 

针对IGF-I和IGF-I R基因和参照基因ACTB的扩增片段，合成与对应引物扩增序列相比插入3bp碱基的DNA片段为内对照序列，并进行精确定量，配制内对照DNA混合液，梯度稀释至10³～10⁴个分子／μl； 

3)多重竞争性PCR反应 

a)肝脏总RNA提取按TRNzol-A⁺总RNA提取试剂盒(DP421)的说明书进行， RNA样品经1.4％琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测，OD_260/2801.8～2.0，保证RNA样品质量可靠，均一化RNA浓度至1μg/μl，取1μg总RNA，cDNA第1链的合成按照反转录试剂盒QuantScript RT Kit，KR103-04的使用说明书进行； 

b)配制PCR引物混合液，含3对0.5μM的嵌合特异引物P1、P2；P3、P4和P5、P6，20μM的通用引物，两者等比例混合； 

c)多重PCR反应体系10×GT Buffer含34mM Mg²⁺1.5μl，100mM Mg²⁺0.09μl，dNTP mix各2.5mM3μl，Primers引物混合物3μl，Taq DNA Polymerase5units／μl0.75μl，Templates cDNA1.5μl，BSA10mg／ml0.21μl，内对照DNA1ul，DEPC H₂O补水至15μl，反应过程为94℃2min，94℃30s，62℃90s，65℃1min，20cycles；94℃2min，94℃30s，53℃90s，68℃1m，68℃20min，18cycles； 

d)取1μl PCR产物，加入8.6μl的Hi-Di和0.4μl的DNA分子标准，上述混合物95℃，变性5min，然后迅速冰水浴2min，离心后用ABI测序仪3730检测，电泳结果经GeneScan Analysis3.0和GeneMapper ID software v3.2软件分析获得每个基因位点的样本条带／内对照条带大小、峰高、峰面积的数据，产物大小由DNA分子标准得出，峰高或峰面积用于判断PCR产物的量； 

4)数据分析 

a)计算每个基因位点的比值(S)／内对照DNA条带(I)的荧光峰高或峰面积之比S／I； 

b)将每个目标基因位点的比值(S／I)分别除以参照基因的比值(S／I)即可获得样本目标基因的相对表达量。 

与现有技术相比，本发明的有益效果为： 

本发明一种鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒及使用方法，将设计独特、稳定和高效的试剂盒与MCF-PCR技术结合，是一种可靠、便捷、价格低廉的检测方法。 

附图说明

图1是本发明鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒的结构示意图。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明 

参照图1，一种鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒，包括盒体1和 隔离垫2，还包括IGF-I基因嵌合特异上下游引物3、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物4、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物5、IGF-I基因内对照DNA6、IGF-I R基因内对照DNA7、Tag酶DNA连接酶8。 

一种本发明所述的鸭IGF-I和IGF-I R基因mRNA表达量联合检测的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤： 

4)引物设计 

通用引物的设计： 

设计原则保证上下游引物的TM值≤58℃，为了避免通用引物带来非特异产物，通用引物的长度为18bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记； 

嵌合特异引物的设计： 

根据GenBank数据库中目标基因IGF-I和IGF-I R及参照基因ACTB基因的cDNA序列信息，设计了3对20～26bp长的序列作为嵌合特异引物，TM值≥61℃，扩增产物长度在200～310bp之间，相邻产物长度的差大于10bp，之后与通用引物组成嵌合特异引物，且在通用引物的3’端插入ct两个碱基，引物经Blast和Oligo mask软件分析，确保特异性扩增； 

IGF-I基因嵌合特异上下游引物P1和P2、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物P3和P4、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物P5和P6，P1～P6六条引物详细信息如下，每条引物中小写ct前是通用引物，小写ct后为特异引物： 

IGF-I基因嵌合特异上游引物P1表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’ 

IGF-I基因嵌合特异下游引物P2表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3’ 

IGF-I R基因嵌合特异上游引物P3表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’ 

IGF-I R基因嵌合特异下游引物P4表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3’ 

参照基因ACTB嵌合特异上游引物P5表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’ 

参照基因ACTB嵌合特异下游引物P6表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3’； 

5)合成内对照DNA片段 

针对IGF-I和IGF-I R基因和参照基因ACTB的扩增片段，合成与对应引物扩增序列相比插入3bp碱基的DNA片段为内对照序列，并进行精确定量，配制内对照DNA混合液，梯度稀释至10³～10⁴个分子／μl； 

6)多重竞争性PCR反应 

a)肝脏总RNA提取按TRNzol-A⁺总RNA提取试剂盒(DP421)的说明书进行，RNA样品经1.4％琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测，OD_260／2801.8～2.0，保证RNA样品质量可靠，均一化RNA浓度至1μg/μl，取1μg总RNA，cDNA第1链的合成按照反转录试剂盒QuantScript RT Kit，KR103-04的使用说明书进行； 

b)配制PCR引物混合液，含3对0.5μM的嵌合特异引物P1、P2；P3、P4和P5、P6，20μM的通用引物，两者等比例混合； 

c)多重PCR反应体系10×GT Buffer含34mM Mg²⁺1.5μl，100mM Mg²⁺0.09μl，dNTP mix各2.5mM3μl，Primers引物混合物3μl，Taq DNA Polymerase5units／μl0.75μl，Templates cDNA1.5μl，BSA10mg／ml0.21μl，内对照DNA1ul，DEPC H₂O补水至15μl，反应过程为94℃2min，94℃30s，62℃90s，65℃1min，20cycles；94℃2min，94℃30s，53℃90s，68℃1m，68℃20min，18cycles； 

d)取1μl PCR产物，加入8.6μl的Hi-Di和0.4μl的DNA分子标准，上述混合物95℃，变性5min，然后迅速冰水浴2min，离心后用ABI测序仪3730检测，电泳结果经GeneScan Analysis3.0和GeneMapper ID software v3.2软件分析获得每个基因位点的样本条带／内对照条带大小、峰高、峰面积的数据，产物大小由DNA分子标准得出，峰高或峰面积用于判断PCR产物的量； 

4)数据分析 

a)计算每个基因位点的比值(S)／内对照DNA条带(I)的荧光峰高或峰面积之比S／I； 

b)将每个目标基因位点的比值(S／I)分别除以参照基因的比值(S／I)即可获得样本目标基因的相对表达量。 

实施例1，运用本发明提供的试剂盒和方法对4周龄高邮鸭的肝脏组织进行相对定量分析。 

1、样品及RNA提取 

采集4周龄高邮鸭肝脏组织5份。肝脏总RNA提取按TRNzol-A⁺总RNA提取试剂盒(DP421)的说明书进行。RNA样品经1.4％琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检 测，OD_260／2801.8～2.0，保证RNA样品质量可靠，均一化RNA浓度至1μg/μl。 

2、引物设计 

引物设计按照所述方法步骤1执行。IGF-I基因嵌合特异上下游引物(P1和P2)、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物(P3和P4)、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物(P5和P6)。 

IGF-I基因嵌合特异上游引物P1表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’ 

IGF-I基因嵌合特异下游引物P2表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3’ 

IGF-I R基因嵌合特异性上游引物P3表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’ 

IGF-I R基因嵌合特异下游引物P4表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3 

参照基因ACTB嵌合特异上游引物P5表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’ 

参照基因ACTB嵌合特异下游引物P6表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3’ 

3、IGF-I、IGF-I R和ACTB基因竞争性PCR反应 

多重竞争性PCR反应按照试剂盒使用方法步骤2进行。 

4、数据分析如表1所示： 

表1 

实施例2，运用本发明提供的试剂盒和方法对2周龄金定鸭的肝脏组织进行相对定量分析。 

1、样品及RNA提取 

采集2周龄金定鸭肝脏组织3份。肝脏总RNA提取按TRNzol-A⁺总RNA提取试剂盒(DP421)的说明书进行。RNA样品经1.4％琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测，OD_260／2801.8～2.0，保证RNA样品质量可靠，均一化RNA浓度至1μg/μl。 

2、引物设计 

引物设计按照所述方法步骤1执行。IGF-I基因嵌合特异上下游引物(P1和P2)、IGF-I R基因嵌合特异上下游引物(P3和P4)、参照基因ACTB基因嵌合特异上下游引物(P5和P6)。 

IGF-I基因嵌合特异上游引物P1表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’ 

IGF-I基因嵌合特异下游引物P2表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3’ 

IGF-I R基因嵌合特异上游引物P3表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’ 

IGF-I R基因嵌合特异下游引物P4表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3 

参照基因ACTB嵌合特异上游引物P5表示的信息为： 

5’-AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’ 

参照基因ACTB嵌合特异下游引物P6表示的信息为： 

5’-ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3’ 

3、IGF-I、IGF-I R和ACTB基因竞争性PCR反应 

多重竞争性PCR反应按照试剂盒使用方法步骤2进行。 

4、数据分析如表2所示： 

表2 

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。