CD44+肿瘤干/祖细胞在前列腺癌侵袭和转移中的作用和机制研究

摘要

前列腺癌已然成为世界公认的危害人类健康的最常见的泌尿生殖系肿瘤之一。绝大多数早期前列腺癌患者在接受雄激素剥夺治疗一段时间以后，患者开始对治疗产生耐受，病情进一步进展，为了探讨其中可能的原因。我们开展了此项课题研究。
　　首先研究了雄激素剥夺治疗(ADT)与前列腺癌上皮-间质转化（EMT）及CD44+肿瘤干/祖细胞生成的关系。通过收集激素敏感性、经 ADT治疗3个月和经 ADT后进展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）患者的肿瘤标本组织进行免疫组织化学染色方法分析上皮和间质标志物的表达水平变化差异。我们假设前列腺癌经ADT后能促进EMT现象的发生。为了验证这一假设，我们应用了前列腺LNCaP老鼠原位肿瘤模型和去势抵抗性前列腺TRAMP老鼠原位肿瘤模型。建立前列腺LNCaP原位肿瘤老鼠模型，分别收集激素敏感期的肿瘤组织标本，ADT治疗3天的原位肿瘤组织标本以及去势后变为激素非依赖的去势抵抗性LNCaP原位肿瘤老鼠模型组织标本，检测组织标本中上皮和间质标志物的变化情况。建立TRAMP老鼠模型，于第12周龄时采取去势处理，收集第16周，20周和24周的肿瘤组织标本，进行免疫组织化学染色及免疫组织荧光染色方法分析上皮和间质标志物的变化情况，以及CD44和CK5/CK8的表达情况。结果发现前列腺癌患者在经ADT治疗3个月后上皮的标志物E-Cadherin表达减少，间质的标志物N-Cadherin和Vimentin表达升高，且随着前列腺癌的进展，上皮的标志物表达逐渐减少，间质的标志物表达逐渐增多。成功建立激素依赖性、经ADT治疗后3天和非依赖性LNCaP原位肿瘤裸鼠模型，并应用免疫组织化学方法证实裸鼠经ADT治疗后同样存在E-Cadherin表达减少，N-Cadherin和Vimentin表达升高。TRAMP原位肿瘤老鼠模型的组织标本进行免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色分析证实前列腺癌的进展过程中伴随着EMT现象的发生和CD44+肿瘤细胞的增多。
　　紧接着我们进一步探讨了CD44+肿瘤干/祖细胞通过TGFβ1-EMT信号通路促进前列腺癌侵袭和转移的机制，同样收集激素敏感性、经ADT治疗3个月和去势抵抗性前列腺癌患者的肿瘤标本组织进行免疫组织化学染色方法分析TGF-β1的变化情况。建立TRAMP老鼠模型，于第12周龄时采取去势处理，收集第16周和24周的肿瘤组织标本，采用免疫组织化学染色方法分析TGF-β1的变化情况。将LNCaP和CWR22RV1两种前列腺癌细胞系用5ng/mL TGF-β1处理后分别于0小时，3小时，6小时，9小时行流式细胞分选检测CD44+细胞的比例变化。采用RT-PCR分析经5ng/mL TGF-β1处理的LNCaP细胞系中CD44，C-Met，Nanog，Oct-4和Sox-2等干细胞标志物，以及E-Cadherin、Vimentin的表达水平。采用克隆形成实验分析经5ng/mL TGF-β1处理的LNCaP细胞系中克隆球形成的数量变化。采用Western blot方法分析经TGF-β1处理后上述两种前列腺癌细胞系中CD44的表达水平，以及引入TGF-β1信号通路阻断剂SB431542后检测CD44表达水平的变化，或敲除CD44后检测上皮和间质标志物的变化。运用Transwell侵袭性实验分析CD44在前列腺癌侵袭中的作用。采用免疫组织化学染色分析TRAMP前列腺癌老鼠模型转移瘤中CD44的表达水平，以期证实CD44在前列腺癌转移中的作用。发现经人前列腺癌组织标本免疫组织化学染色证实ADT治疗后TGF-β1表达升高，且随着前列腺癌的进展，其表达逐渐升高。上述结果在经过去势处理的第16和24周的TRAMP老鼠模型肿瘤组织标本中得到进一步验证。经TGF-β1处理的前列腺癌细胞系中CD44+细胞的比例随时间的延长逐渐增多，且肿瘤干细胞的标志物表达升高，克隆球的数量也明显增多。采用 TGF-β1信号通路阻断剂 SB431542后证实 CD44的表达明显减少。敲除CD44后间质的标志物表达明显减少，肿瘤细胞侵袭性降低。去势后TRAMP前列腺癌老鼠模型转移瘤中CD44的表达水平明显升高。
　　为了观察盐霉素靶向CD44+干/祖细胞后前列腺癌侵袭和转移力的变化，采用Western blot方法分析经盐霉素处理后的LNCaP和CWR22RV1两种前列腺癌细胞系中 CD44的表达水平来评价盐霉素对 CD44+细胞的作用效果。采用免疫组织化学染色分析经盐霉素处理的CWR22RV1裸鼠模型组织切片标本中干细胞标志物CD44，C-Met，Nanog，Oct-4和Sox-2，以及E-Cadherin、Vimentin的表达水平。建立CWR22RV1裸鼠模型，并分析经盐霉素处理后原位肿瘤的体积变化以及远处转移瘤的数量，体积大小。发现经盐霉素处理后的LNCaP和CWR22RV1两种前列腺癌细胞系中 CD44的表达均较少。经盐霉素处理的CWR22RV1裸鼠模型中原位肿瘤的体积较小，远处转移瘤的数量较少和体积较对照组小；经盐霉素处理的CWR22RV1裸鼠模型中原位肿瘤组织切片标本中干细胞标志物CD44，C-Met，Nanog，Oct-4和Sox-2表达减少，E-Cadherin表达增多以及 Vimentin表达减少。从而得出如下结论：1. ADT治疗后促进前列腺癌上皮间质化（EMT）及CD44+干/祖细胞数量增加。2. CD44+干/祖细胞通过TGFβ1-EMT信号通路促进前列腺癌的侵袭和转移。3.盐霉素通过靶向作用于前列腺癌 CD44+干/祖细胞并有效抑制其增值从而达到抑制前列腺癌侵袭和转移的效果，或许可以成为治疗前列腺癌的新药。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、ADT诱导EMT并促进CD44+肿瘤干/祖细胞数量增加

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、CD44+肿瘤干/祖细胞促进前列腺癌进展的机制研究

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、抗CD44+肿瘤干/祖细胞药物盐霉素抑制前列腺癌进展

3.1对象和方法

3.2结果

2.3讨论

2.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:肿瘤干细胞和上皮-间质转化在前列腺癌进展过程中的作用及机制研究

致谢