玛咖叶总黄酮和多糖的提取分离及其抗氧化活性研究

摘要

玛咖(Lepidium meyenii Walp，Maca)是一种原产秘鲁的药食同源性植物，具有抗疲劳、提高生育能力、调节内分泌和提高免疫力等药理作用。目前，国内外研究热点多集中于玛咖根，对玛咖叶的研究却鲜有报道。随着玛咖在我国的大规模推广种植，对玛咖叶进行活性成分的研究有利于玛咖的综合利用，提高农民收入，推动经济发展。
　　论文以玛咖叶为试验原料，对玛咖叶多糖进行了提取工艺优化、分离纯化、结构表征及体外抗氧化活性研究，并对玛咖叶总黄酮进行了提取工艺优化和体外抗氧化活性探索。实验结果表明，玛咖叶多糖最佳提取工艺为:料液比(mL/g)38∶1、提取时间150 min、提取温度100℃、提取3次，在此最佳工艺条件下多糖实际得率为14.20±0.25％，该结果接近预测值。通过DEAE-52离子交换树脂和葡聚糖凝胶G-200对玛咖叶多糖进行分离纯化，得到两种纯多糖MLP-1和MLP-2。经红外光谱、紫外光谱及理化性质测定结果显示，MLP-1和MLP-2具有多糖的特征吸收峰，不含蛋白质、核酸和色素等杂质，具有多糖类化合物的一般性质。通过高效凝胶渗透色谱法测定MLP-1和MLP-2的分子量分别为2034.528 Da和3137.699 Da;通过GC-MS技术对单糖组成分析，结果显示MLP-1的单糖组成为核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩尔比为0.12∶0.32∶1.50∶0.32∶1.03∶1.00∶0.93; MLP-2的单糖组成为葡萄糖，即MLP-2为葡聚糖。MLP-1和MLP-2对羟基自由基的清除率IC50(mg/mL)分别为0.44和0.66，DPPH自由基的清除率IC50(mg/mL)分别为0.82和1.11，超氧阴负离子自由基的清除率IC50(mg/mL)分别为0.21和1.01。通过响应面法优化，得到玛咖叶总黄酮的最佳提取工艺为:乙醇体积分数65％、提取温度64℃、料液比(mL/g)29∶1、提取时间90 min、提取2次，在此最佳工艺条件下实际的总黄酮得率达到了2.49±0.02％，该结果与预测值接近。玛咖叶总黄酮对羟基自由基、DPPH自由基和超氧阴负离子自由基的清除率IC50(mg/mL)分别为0.61、0.17和0.43。论文结果对玛咖叶的进一步研究和综合利用具有一定的理论应用价值。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 玛咖简介

1．1．1 玛咖的命名

1．1．2 玛咖的分布及植物学特征

1．1．3 玛咖的主要化学成分及药理作用

1．2 玛咖在中国的发展

1．3 植物叶中多糖类化合物研究进展

1．3．1 植物叶多糖结构特点

1．3．2 植物叶多糖药理作用

1．3．3 植物叶多糖提取方法研究进展

1．3．4 植物叶多糖分离与纯化方法研究进展

1．4 植物叶中黄酮类化合物研究进展

1．4．1 基本结构

1．4．2 植物叶黄酮药理作用

1．4．3 植物叶黄酮提取方法研究进展

1．5 响应面法简介

1．6 本课题研究依据及主要研究内容

1．6．1 立题依据

1．6．2 研究内容

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 原料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 标准曲线的绘制及方法学验证

2．2．1 葡萄糖标准曲线的绘制

2．2．2 芦丁标准曲线的绘制

2．2．3 方法学验证

2．3 玛咖叶总黄酮和多糖试验流程

2．4 玛咖叶多糖提取工艺优化

2．4．1 多糖得率的计算

2．4．2 多糖提取单因素试验

2．4．3 多糖提取中心组合试验设计

2．5 玛咖叶多糖分离纯化

2．5．1 玛咖叶粗多糖(MLPs)的制备

2．5．2 DEAE-52柱层析纯化

2．5．3 葡聚糖凝胶G-200柱层析再纯化

2．5．4 多糖红外光谱扫描

2．5．5 多糖紫外光谱扫描

2．6 玛咖叶多糖的基本理化性质检验

2．6．1 溶解性检验

2．6．2 碘反应检验

2．6．3 CATB(十六烷基三甲基溴化铵)络合反应检验

2．6．4 蒽酮反应检验

2．6．5 α-萘酚反应检验

2．7 玛咖叶多糖的分子量测定

2．7．1 试验条件

2．7．2 标准曲线的绘制

2．7．3 样品测定

2．8 玛咖叶多糖的单糖组成分析

2．8．1 多糖的水解

2．8．2 多糖的衍生化

2．8．3 试验条件

2．8．4 标准品测定

2．8．5 样品测定

2．9 玛咖叶多糖体外抗氧化活性试验

2．9．1 多糖羟基自由基清除能力测定

2．9．2 多糖DPPH自由基清除能力测定

2．9．3 多糖超氧阴负离子自由基清除能力测定

2．10 玛咖叶总黄酮提取工艺优化

2．10．1 总黄酮得率的计算

2．10．2 总黄酮提取单因素试验

2．10．3 总黄酮提取中心组合试验设计

2．11 玛咖叶总黄酮体外抗氧化活性测定

2．11．1 总黄酮样品的制备

2．11．2 总黄酮羟基自由基清除能力测定

2．11．3 总黄酮DPPH自由基清除能力测定

2．11．4 总黄酮超氧阴负离子自由基清除能力测定

2．12 数据统计分析

3 结果与讨论

3．1 方法学验证

3．1．1 精密度试验

3．1．2 重复性试验

3．1．3 稳定性试验

3．1．4 加样回收率试验

3．2 玛咖叶多糖提取工艺优化

3．2．1 玛咖叶多糖提取单因素试验结果

3．2．2 多糖提取中心组合试验及其结果

3．2．3 多糖提取响应面结果

3．2．4 多糖提取响应面回归模型的方差分析

3．2．5 多糖提取最佳工艺及其验证试验结果

3．3 玛咖叶多糖的分离纯化

3．3．1 DEAE-52柱层析纯化玛咖叶多糖

3．3．2 葡聚糖凝胶G-200再纯化玛咖叶多糖

3．3．3 玛咖叶多糖红外光谱扫描

3．3．4 玛咖叶多糖紫外光谱扫描

3．4 玛咖叶多糖的基本理化性质检验

3．5 玛咖叶多糖的分子量测定

3．6 玛咖叶多糖的单糖组成分析

3．7 玛咖叶多糖体外抗氧化活性试验结果

3．7．1 多糖对羟基自由基的清除能力

3．7．2 多糖对DPPH自由基的清除能力

3．7．3 多糖对超氧阴负离子自由基的清除能力

3．8 玛咖叶总黄酮提取工艺优化

3．8．1 总黄酮提取单因素试验

3．8．2 总黄酮提取中心组合试验及其结果

3．8．3 总黄酮提取条件响应面结果

3．8．4 总黄酮提取响应面回归模型的方差分析

3．8．5 总黄酮提取最佳工艺及其验证试验结果

3．9 咖叶总黄酮体外抗氧化活性测定

3．9．1 总黄酮对羟基自由基的清除能力

3．9．2 总黄酮对DPPH自由基的清除能力

3．9．3 总黄酮对超氧阴负离子自由基的清除能力

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢