甘蔗叶片cDNA文库构建及SPS前体mRNA选择性剪接初步研究

摘要

甘蔗是世界上最重要的糖能兼用作物。本研究应用LD-PCR方法合成cDNA二链，琼脂糖胶回收法分级纯化回收双链cDNA，回收产物克隆至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5a，获得了甘蔗高糖品种(FN95-1702)叶片cDNA文库。文库库容为1.8×106个克隆，重组率达98.6％，插入片段长度集中在0.6～2.5 kb，平均插入片段长度约为1.2 kb。利用该文库克隆了果糖-1,6-二磷酸酯酶基因、ADP/ATP转运蛋白酶基因和天冬氨酸蛋白酶基因的cDNA片段，并对其进行了生物信息学分析。研究结果可为甘蔗糖代谢及胁迫信号转导研究提供基础。 本研究从甘蔗叶和茎中获得了糖代谢途径的关键酶--蔗糖磷酸合成酶基因的6个不同长度的cDNA片段。经RT-PCR分析初步证明了这是SPS的不同形式的剪接体，SPS前体mRNA具有选择性剪接现象。进一步的RT-PCR实验表明，在1个斑茅品种和9个不同的甘蔗品种中均存在SPS前体mRNA的选择性剪接现象。这在植物SPS上是首次发现。选择性剪接现象的发现，可为SPS前体mRNA选择性剪接机理研究奠定基础，更可为在转录水平上调控SPS的表达提供新的研究方向。

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摘要

中文文摘

第1章绪论

1.1前言

1.2文献综述

1.2.1构建全长cDNA文库的方法比较及其应用

1.2.2前体mRNA选择性剪接分子机制研究进展

1.3本研究的目的和意义

第2章甘蔗叶片cDNA文库的构建及基因克隆

2.1材料与试剂

2.1.1植物材料与菌株

2.1.2主要试剂和酶

2.2方法

2.2.1总RNA提取

2.2.2 RNA质量检测

2.2.3 mRNA的分离

2.2.4 cDNA文库构建

2.2.5基因克隆及生物信息学分析

2.3结果与分析

2.3.1甘蔗总RNA的提取

2.3.2 mRNA的分离

2.3.3双链cDNA的合成

2.3.4双链cDNA与载体的连接效率分析

2.3.5转化E.coli DH5α转化效率分析

2.3.6测定未扩增文库库容和重组克隆百分比

2.3.7 cDNA文库插入片段长度的PCR检测

2.3.8基因克隆及生物信息学分析讨论

2.4讨论

2.4.1 LD-PCR在cDNA文库构建中的应用

2.4.2双链cDNA的纯化回收

2.4.3 T载体在cDNA文库构建中的应用

2.4.4减少cDNA文库构建中间步骤的作用

第3章SPS前体mRNA剪接体的克隆和序列分析

3.1实验材料

3.1.1材料与菌株

3.1.2主要试剂和酶

3.2实验方法

3.2.1核酸提取

3.2.2 PCR引物的设计与合成

3.2.3 PCR反应及其产物回收

3.2.4回收产物的连接和转化

3.2.5重组质粒的提取和PCR检测酶切鉴定

3.2.6测序及序列分析

3.2.7 RT-PCR检测SPS选择性剪接体

3.3结果与讨论

3.3.1核酸的提取

3.3.2 SPS的cDNA片段克隆

3.3.3重组质粒的提取和PCR检测、酶切鉴定

3.3.4测序及序列分析

3.3.5 RT-PCR检测SPS的选择性剪接

3.3.6 SPS不同剪接体的序列分析

3.3.7 SPS出现不同形式剪接体的可能分子机制讨论

结论

附录1符号缩略表

附录2溶液配方

参考文献

攻读学位论文期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历