溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库构建方法

摘要

一种溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库构建方法，以溶藻弧菌为材料，用提取总RNA、反转录、应用RD－PCR技术扩增反转录得到的双链DNA、分子克隆及ESTs生物信息学等方法对该菌进行研究。此方法具有质量高，所筛选的基因片段重复性低，筛选基因片段效率高，目的性强等特点。该文库应用了RD－PCR技术，对欲克隆的基因片段进行了扩增，由于酶切后片段大小较均一，可以有效地避免PCR对短片的优先扩增，防止所构建的cDNA文库出现明显偏向，在这点上优于一般PCR介导的cDNA文库构建法。该文库可以作为深入研究溶藻弧菌毒力因子以及致病机理的基础；能为研制新型基因工程疫苗提供新的思路。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物学、生物化学、分子生物学、生物信息学领域，特别是涉及一种溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库构建方法。

背景技术：

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛存在于世界各地海水和海产品中，是海水养殖动物如鱼、虾、贝类等的主要致病菌，同时也是引起人食物中毒和急性腹泻的重要病原菌。目前，大多数学者对该细菌的研究主要集中在外膜蛋白及抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体方面，然而，对于溶藻弧菌文库构建，功能基因，毒力因子的研究尚缺乏。

自1976年首例cDNA克隆问世以来，cDNA文库构建方法有了很大进步，已成为真核生物分子生物学的基本手段，但在原核生物却几乎止步不前。这是因为细菌mRNA代谢快速高效，半衰期仅为几分钟，3′端poly(A)尾少、短和不稳定，使得mRNA的纯化和用oligo(dT)逆转录均存在较大困难，若沿用真核cDNA文库构建方法，即便是克隆成功，cDNA文库也会存在大量的冗余和重复的信息，所获得的多个大小不同克隆可能都来自同一基因不同状态的mRNA。目前仅有胡子有等人利用oligo(dT)与poly(A)特异结合的特性从E.coli中纯化出mRNA，用olio(dT)为引物逆转录，并用限制性显示PCR技术(restriction display-PCR)，克隆了100多个基因片段，并对其中40个片段进行了测序及分析。

发明内容：

本发明的目的是弥补上述现有技术存在的不足，提供一种溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库构建方法。

为实现上述目的本发明采取的技术方案是：构建步骤包括：提取总RNA、反转录、应用RD-PCR技术扩增反转录得到的双链DNA、分子克隆及ESTs生物信息学5步方法。

所述构建溶藻弧菌cDNA文库方法如下：

(1)模板制备

①取保存的溶藻弧菌菌株，平板划线后28℃培养24小时，挑取单菌落转移至100ml液态TSA培养基中，28℃震荡培养8小时，细菌的培养时间不宜过长，以8-10小时为佳，否者RNA提取效果不好，容易降解。测A₆₀₀约为0.6；

②总RNA的制备使用EZ spin column total RNA lsolation Kit(购于上海生工生物工程公司)试剂盒进行，用BIO-TEK酶标仪进行定量，取2μLRNA进行1.5％琼脂糖电泳检测，并对提取的总RNA用无RNase的DNase I进行消化，以防痕量基因组DNA污染。mRNA的纯化用Omega Biotek的E.Z.N.A mRNAEnrichment Kit，按说明书操作；

(2)cDNA合成

cDNA第一链合成按Superscript III(购于Invitragen公司)的说明书进行，第二链的合成按照以下方法进行，具体方法如下：加入第一链产物2μL，10×大肠杆菌DNA聚合酶缓冲液(10×E.coli DNA polymeraseBuffer)30μL，大肠杆菌DNA聚合酶(E.coli DNA polymerase)12U，10mM dNTP 3μL，大肠杆菌RNA酶抑制剂(E.coli RNase H)120U，大肠杆菌DNA连接酶(E.coli DNA Ligase)100U，无RNA酶水(RNase free H2O)89μL后，轻轻搅拌，16℃，2小时，然后70℃加热10分钟，加入T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)20U，10mM dNTP 3μL，BSA 2μL，37℃反应10分钟，加入15μL EDTA(0.25mM)终止反应。

(3)RD-PCR

①取寡核苷酸片段SIP(500μg/ml)和SIR(330μg/ml)等体积于一PCR管内混匀，在PCR仪上加热至90℃5分钟，随后在30分钟内使其温度逐渐降低到室，形成的接头(SIP/SIR)经分装后于-20℃贮存备用；

②逆转录获得的cDNA2μL(约1μg)，加入Sau3A I 1.5μL，2μL 10×反应缓冲液，于20μL总反应体积中37℃酶切3小时，然后70℃10分钟。然后取产物5μL和6μL接头，用T4连接酶1μL，30μL总反应体积，16℃连接3小时即可用于RD-PCR模板。取连接产物1μL，Taq聚合酶1μL(5U)，dNTP mixture 1μL，10×PCR缓冲液(10×PCR Buffer)5μL，配对的选择引物(如MG和MA，浓度均为10umol/l)各取1μL，50μL总反应体系进行PCR。PCR反应条件如下：94℃变性5分钟，然后94℃30秒，65℃30秒，72℃1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。4种不同选则性引物MA、MG、MT、MC共有十种不同的组合，PCR分成10组进行。若酶切加接头连接产物直接做模板，PCR产物不理想，可先用通用引物扩增，再以通用引物扩增后的产物做模板，再进行选择性PCR。

(4)分子克隆及分析

①RD-PCR产物使用T载体连接，具体操作参见PMD18-T载体(购于大连宝生物工程有限公司)说明书。经快速PCR鉴定，并经小量培养阳性菌落后寄往上海英俊生物工程公司进行测序；

②测序结果使用BLASTX程序将处理后的EST序列在蛋白质水平上与NCBI非冗余蛋白质数据库(non-redundant protein database)进行同源性比较。所有参数设置均使用默认值。序列对齐分值(score)大于80且序列同一性大于35％的搜索结果认为有生物学意义上的显著相似性。挑选其中分值最高的蛋白质作为相应EST最有可能的翻译产物

所述一种构建溶藻弧菌cDNA文库方法，其性质要点为：

(1)首次证明了在溶藻弧菌确实存在poly(A)尾，并应用该特性使用oligo(dT)成功进行了反转录；

(2)首次报道提取溶藻弧菌总RNA时该细菌的培养时间不能超过8小时，否者降解现象严重；

(3)首次报道溶藻弧菌III型分泌系统易位蛋白(translocation protein intype III secretion)III型分泌途径分子伴侣EscU(Type III secretory pathway，component EscU)、趋药性传感器(putative chemotaxis transducer)、类丝氨酸蛋白酶(Secreted trypsin-like serine protease)四个与溶藻弧菌得力基因有关的基因片段；

鉴于原核生物细菌的特殊性质，本发明采用oligo(dT)₁₈为逆转录引物合成cDNA，采用限制性显示PCR(RD-PCR)技术从溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)克隆了100多个基因片段，构建溶藻弧菌的cDNA文库，并对其中的53个基因片段进行了测序鉴定，通过生物信息学分析，利用表达序列标签(ESTs)技术对溶藻弧菌基因进行研究，获得了一些与溶藻弧菌致病性有关的基因以及功能基因，这对于我们进一步深入研究溶藻弧菌致病机理、制备弧菌工程疫苗、寻求弧菌病害防治新方法方面具有重要意义。

该溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文库构建方法，以溶藻弧菌为材料，用提取总RNA、反转录、应用RD-PCR技术扩增反转录得到的双链DNA、分子克隆及ESTs生物信息学等方法对该菌进行研究。此方法具有质量高，所筛选的基因片段重复性低，筛选基因片段效率高，目的性强等特点。该文库应用了RD-PCR技术，对欲克隆的基因片段进行了扩增，由于酶切后片段大小较均一，可以有效地避免PCR对短片的优先扩增，防止所构建的cDNA文库出现明显偏向，在这点上优于一般PCR介导的cDNA文库构建法。我们通过该方法克隆了100多个片段，并通过对克隆测序片段进行EST序列分析，我们比对到有4个与溶藻弧菌毒力相关的基因序列。构建溶藻弧菌cDNA文库方法以及一些新的生物信息学分析结果：其性质要点是：

(1)首次证明了在溶藻弧菌确实存在poly(A)尾，并应用该特性使用oligo(dT)成功进行了反转录；

(2)首次报道提取溶藻弧菌总RNA时该细菌的培养时间不能超过8小时，否者降解现象严重；

(3)首次报道溶藻弧菌III型分泌系统易位蛋白(translocation protein intype III secretion)、III型分泌途径分子伴侣EscU(Type III secretorypathway，component EscU)、趋药性传感器(putative chemotaxistransducer)、类丝氨酸蛋白酶(Secreted trypsin-like serine protease)四个与溶藻弧菌得力基因有关的基因片段；

本发明对比其他文库构建方法的优点在于：

(1)总结出提取总RNA时溶藻弧菌培养的最佳时间，为以后研究其他种类的弧菌提供一个时间参考。

(2)验证了细菌中确实也存在poly(A)尾，这为在构建细菌cDNA文库时可以利用poly(A)尾与oligo(dT)特异结合的特性进行反转录提供一定的理论基础。

(3)发现溶藻弧菌III型分泌系统、III型分泌途径分子伴侣EscU、趋药性传感器、类丝氨酸蛋白酶基因片段，为更好的研究该细菌的致病机理以及找到新药的靶位点提供新的思路。

具体实施方式：

本发明用下列实施例来进一步说明。

实施例1

(1)模板制备

①取保存的溶藻弧菌菌株，平板划线后28℃培养24小时，挑取单菌落转移至100ml液态TSA培养基中，28℃震荡培养8小时，细菌的培养时间不宜过长，以8-10小时为佳，否者RNA提取效果不好，容易降解。测A₆₀₀约为0.6；

②总RNA的制备使用EZ spin column total RNA lsolation Kit(购于上海生工生物工程公司)试剂盒进行，用BIO-TEK酶标仪进行定量，取2μLRNA进行1.5％琼脂糖电泳检测，并对提取的总RNA用无RNase的DNase I进行消化，以防痕量基因组DNA污染。mRNA的纯化用Omega Biotek的E.Z.N.A mRNAEnrichment Kit，按说明书操作；

(2)cDNA合成

cDNA第一链合成按Superscript III(购于Invitragen公司)的说明书进行，第二链的合成按照以下方法进行，具体方法如下：加入第一链产物2μL，10×大肠杆菌DNA聚合酶缓冲液(10×E.coli DNA polymerase Buffer)30μL，大肠杆菌DNA聚合酶(E.coli DNA polymerase)12U，10mM dNTP 3μL，大肠杆菌RNA抑制剂(E.coli RNase H)120U，大肠杆菌DNA连接酶(E.coliDNA Ligase)100U，无RNA酶水(RNase free H₂O)89μL后，轻轻搅拌，16℃，2小时，然后70℃加热10min，加入T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)20U，10mM dNTP 3μL，BSA 2μL，37℃反应10min，加入15μL EDTA(0.25mM)终止反应。

(3)RD-PCR

①取寡核苷酸片段SIP(500μg/ml)和SIR(330μg/ml)等体积于一PCR管内混匀，在PCR仪上加热至90℃5分钟，随后在30分钟内使其温度逐渐降低到室，形成的接头(SIP/SIR)经分装后于-20℃贮存备用；

②将逆转录获得的cDNA2μL(约1μg)，加入Sau3AI 1.5μL，2μL 10×反应缓冲液，于20μL总反应体积中37℃酶切3小时，然后70℃10分钟。然后取产物5μL和6μL接头，用T4连接酶1μL，30μL总反应体积，16℃连接3小时即可用于RD-PCR模板。取连接产物1μL，Taq聚合酶1μL(5U)，dNTP mixture 1μL，10×PCR缓冲液(10×PCR Buffer)5μL，配对的选择引物(如MG和MA，浓度均为10μmol/l)各取1μL，50总反应体系进行PCR。PCR反应条件如下：94℃变性5分钟，然后94℃30秒，65℃30秒，72℃1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。4种不同选则性引物MA、MG、MT、MC共有十种不同的组合，PCR分成10组进行。若酶切加接头连接产物直接做模板，PCR产物不理想，可先用通用引物扩增，再以通用引物扩增后的产物做模板，再进行选择性PCR。

(4)分子克隆及分析

②RD-PCR产物使用T载体连接，具体操作参见PMD18-T载体(购于大连宝生物工程有限公司)说明书。经快速PCR鉴定，并经小量培养阳性菌落后寄往上海英俊生物工程公司进行测序；

③测序结果使用BLASTX程序将处理后的EST序列在蛋白质水平上与NCBI非冗余蛋白质数据库(non-redundant protein database)进行同源性比较。所有参数设置均使用默认值。序列对齐分值(score)大于80且序列同一性大于35％的搜索结果认为有生物学意义上的显著相似性。挑选其中分值最高的蛋白质作为相应EST最有可能的翻译产物。