柑桔叶片干旱胁迫抑制差减cDNA文库的构建与初步分析

摘要

在各种自然灾害中，旱灾居于首位。在世界范围内，干旱缺水对农业和社会造成的损失相当于其他自然灾害之和。柑桔是世界上产量最大的水果，干旱是柑桔增产的主要限制因子之一。利用分子生物学方法研究柑桔在水分胁迫条件下的应答机制，进而研究其抗旱机理，对于全面认识抗旱性的遗传基础，培育抗旱新品种，研发抗旱栽培技术，具有重要意义。 本研究以柑桔椪柑(Citrus．reticulata)为实验材料，构建干旱胁迫诱导表达基因的抑制差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)cDNA文库，通过对文库的筛选、克隆测序和功能分析，了解柑桔干旱应答机制，为发掘和利用抗旱相关基因奠定基础。 用盆栽兴春椪柑自然干旱胁迫作为处理组(Tester)，正常浇水作为对照组(Drivet)，用本实验室改进的苯酚/氯仿/SDS法分别提取上述两种材料的总RNA，分离纯化，获得高质量mRNA各约4μg。采用SSH试剂盒法进行抑制差减杂交，首先将上述两种材料mRNA进行反转录成双链cDNA，然后进行Rsal酶切，之后将Tester酶切产物分成2份：1份与Adoptorl连接，另1份与Adoptor2R连接，最后进行抑制差减杂交；将抑制差减杂交第二次PCR的产物纯化后连接至pTZ57R/T载体中，转化到DH5 α感受态细胞，经蓝白斑筛选、培养，获得具有438个重组克隆的SSH文库。 将克隆进行菌液PCR检测，得到阳性克隆386个。随机送样测序85个，获得质量较好EST序列78条，其中不重复EST 62条，序列同源性比较结果为90％以上的EST可以在GenBank里找到同源性较高的cDNA，其中80％以上的cDNA源于植物在病原菌诱导、干旱、水分、热击、冷害、盐害等生物或非生物胁迫下特异表达的cDNA文库。在可以找到同源性的EST中，有的在好几个文库中出现，这说明植物所受的各种逆境胁迫都直接或间接影响植物体的水分代谢，各种抗逆反应可能存在某些共同的机制。功能比较分析结果发现有已知功能的EST 51条，根据这些EST所代表的基因的功能可分为8类：代谢、转录、防御、光合作用、蛋白合成、信号传导、能量、未知功能。其中有28个基因与干旱胁迫关系密切，对它们进行了分析讨论。柑桔的干旱胁迫应答过程涉及信号转导、基因的表达调控、物质的合成、防御反应、、活性氧清除和保护光合系统等多种途径。获得与抗干旱胁迫密切相关的钙依赖蛋白激酶、转录因子，脱水素DHN6，、超氧化物歧化酶、NADP--苹果酸酶、热击蛋白、肌醇-1-磷酸合成酶等重要基因的EST。这些EST基本上反映了干旱胁迫下柑桔基因的表达谱。境胁迫

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第1章文献综述

1.1形态结构与抗旱性

1.1.1叶片形态结构特征

1.1.2根的形态结构特征

1.2植物干旱诱导下基因表达和生化变化

1.2.1渗透调节物质

1.2.2活性氧清除的酶类

1.2.3 LEA蛋白(Late Embryogenesis Abundant protein)

1.2.4水通道蛋白又称水孔蛋白(Aquaporin，AQP)

1.3干旱胁迫的信号传导

1.4干旱胁迫下诱导的基因表达途径

1.4.1依赖于ABA的基因表达调节途径

1.4.2不依赖于ABA的表达调节途径

1.5抑制性差减杂交技术

1.5.1抑制性差减杂交技术的原理和实验流程

1.5.2抑制性差减杂交技术的优点与缺点

1.5.3抑制性差减杂交技术在植物差异表达基因研究中的应用

1.5.4抑制性差减杂交技术在植物基因工程研究中的展望

第2章引言

2.1研究的目的与意义

2.2主要技术路线

第3章实验材料与方法

3.1实验材料

3.1.1材料处理

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器

3.1.4常用溶液配制

3.2实验方法

3.2.1总RNA提取与mRNA分离

3.2.2 SSH文库构建

第4章结果与分析

4.1总RNA提取与mRNA分离纯化

4.2 SSH文库的构建

4.2.1反转录及Rsa Ⅰ消化

4.2.2抑制性差减杂交

4.2.3连接与转化

4.3 SSH文库筛选

4.4阳性克隆测序及序列查询分析

第5章讨论

5.1植物材料的处理

5.2柑桔果实总RNA的提取

5.3文库的构建与筛选

5.4干旱胁迫反应基因也参与其他胁迫反应

5.5干旱胁迫诱导表达基因

第6章结论

参考文献

附录

致谢

在学期间所发表的文章与参加项目