DNA甲基化对丹参酚酸类成分积累影响的研究

摘要

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我国传统中医中常用药物之一，是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物。丹参在心血管疾病治疗以及抗氧化等方面都有显著的效果。其主要的活性物质可分为两大类：一类为脂溶性的丹参酮类物质，一类为水溶性的酚酸类物质，它们具有很多种重要的药理活性，特别是具有强大的抗氧化活性。DNA甲基化作为一种常见的主要的表观遗传修饰，是在不改变核苷酸序列的情况下，进行DNA修饰，影响基因的表达，同时它也是重要的环境应激响应。有研究表明，植物受到外界环境刺激时，会产生差异DNA甲基化。因为次生代谢产物被认为是植物在长期进化中对生态环境适应的结果，在植物与生态环境的关系中扮演着非常重要的角色，但是，现在关于植物次生代谢和DNA甲基化关系的研究还非常的少，特别是有关于DNA甲基化调节植物次生代谢产物产生的研究鲜有报道。本文以丹参毛状根为材料，通过不同诱导子处理，检测毛状根生物量、有效成分含量、相关基因表达以及DNA甲基化情况，对丹参酚酸类物质的生物合成调控进行部分探索，并推测DNA甲基化是否在植物次生代谢产生过程的调控中发挥着重要的作用，具体研究如下：
　　1.叶酸对丹参毛状根生长及酚酸类物质积累的影响。方法：首先利用不同终浓度的叶酸（25、50、100、200μmol/L）处理丹参毛状根，6天后检测丹参毛状根中酚酸类成分的含量，获得最优的处理浓度。根据此浓度处理丹参毛状根，诱导1、2、4、6、9d后收集，检测酚酸类物质含量及相关基因表达。结果：1)50μM叶酸效果最明显。与对照相比，鲜重增加了41.3％，迷迭香酸、丹酚酸B和咖啡酸的含量最高值达到0.607mg/g、1.344mg/g和0.015mg/g，分别提高了97.6%、76.7%和77%。2)50μM叶酸诱导下，与对照组相比，咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B及总酚酸含量的增长率在第6天最高，分别被提高了19.8%、49.4%、43.7%和43.2%，咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B的产量在第6天分别被提高了37.7%、71.6%和65.1%。3）PAL和TAT的表达在第一天迅速提升，分别达到了对照的26.6倍和3.4倍，然后它们的表达量渐渐随着时间的推移而回落，直到第9天低于对照组。RAS作为迷迭香酸合成途径下游的关键基因，研究结果表明RAS对于叶酸的响应晚于PAL和TAT。RAS在诱导处理后第2天达到了最高表达量，是对照的21.9倍，同样随着时间的推移，表达水平慢慢回落。
　　2.5-AzaC和SAM对丹参毛状根酚酸类物质积累及相关基因表达调控的研究。方法：利用不同终浓度的5-AzaC（10、100、250、500μM）、SAM（1、10、100、1000μM）处理丹参毛状根，获得最优的处理浓度后再处理丹参毛状根，诱导1、2、3、6、9d后收集，检测酚酸类物质含量及酚酸合成相关基因表达。结果：1）10μM5-AzaC促进效果最明显，毛状根鲜重增加了18.6%，迷迭香酸和丹酚酸B的含量最高值达到了0.732mg/g和1.544mg/g，分别提高了138.2%和103.2%；1000μM SAM抑制作用最明显，毛状根的鲜重降低了28.1%，迷迭香酸的含量降低了72.6%，丹酚酸B的含量甚至降到90%以上。2）10μM5-AzaC诱导下，与对照相比，丹参素在第3天提高了20%，阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B在第6天分别提高了80%、62.3%、33%；1000μM SAM诱导下，阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B和肉桂酸在第6天分别降低了71.8%、78.6%、74.2%和65%。3）10μM5-AzaC：PAL、4CL、C4H、TAT、HPPR、CYP98A14、RAS表达水平均得到提升；1000μM SAM：PAL、4CL、C4H、TAT、HPPR、CYP98A14、RAS表达水平均受到抑制。
　　3.5-AzaC和SAM对甲基化基因表达与酚酸类合成基因启动子甲基化的调控研究。方法：利用荧光定量PCR检测甲基相关基因的表达情况；利用亚硫酸盐处理测序法检测PAL、TAT的甲基化水平。结果：1）10μM5-AzaC：甲基化基因CMT、DEMETER、MET1、MET2、MET3、MET5、MET6表达受到抑制，去甲基化相关基因MBD1、MBD2表达得到提升；1000μM SAM：甲基化基因CMT、DEMETER、MET1、MET2、MET3、MET5、MET6表达得到提升，去甲基化相关基因MBD1、MBD2表达受到抑制。2）检测丹参PAL序列启动子内的15个CpG位点的甲基化情况，5-AzaC处理后，其中5个CpG位点的甲基化状况发生了改变；检测丹参TAT序列启动子范围内11个CpG位点的甲基化情况，5-AzaC处理后，甲基化位点均发生去甲基化，SAM处理后，甲基化位点发生改变，总甲基化不变。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 文献综述

1.1 DNA甲基化概述

1.2 植物DNA甲基化的维持和发生

1.3 DNA去甲基化

1.4 DNA甲基化的检测方法

1.5 植物DNA甲基化与逆境胁迫

1.6 植物次生代谢与逆境胁迫

1.7 丹参的主要成分

1.8 丹参酚酸类物质生物合成途径及调控研究进展

1.9 本研究的目的和意义

第二章 叶酸对丹参毛状根生长及酚酸类物质积累的影响

2.1 引言

2.2材料与方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 5-AzaC和SAM对丹参毛状根酚酸类物质积累及相关基因表达调控的研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四章 5-AzaC和SAM对甲基化基因表达与酚酸类合成基因启动子甲基化的调控研究

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

第五章 总结

参考文献

附录一 培养基配方

致谢