桑黄子实体多糖的分离纯化、结构鉴定及结构修饰研究

摘要

桑黄（PhellinusbaumiiPilát），是担子菌亚门层菌纲多孔菌目多孔菌科针层菌属的一种珍贵的药用真菌。子实体入药最佳，味微苦，能利五脏、软坚、排毒，止血、活血等。民间用以治疗“月水不调”，在日本也作利尿剂使用。文献报道，桑黄子实体多糖具有抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化、抗诱变功能、降血糖等活性。桑黄多糖的初步结构研究已有报道，但进一步的结构及构效关系的研究却未见报道。为了寻找高活性的桑黄多糖并进行构效关系的研究，我们对桑黄子实体中的多糖进行了比较系统的提取、分离、纯化、结构鉴定和化学修饰的研究。 本论文共有三个部分，分别从多糖的分离纯化、理化性质、结构分析和结构修饰进行了研究。主要结果如下： 1.桑黄实体多糖分离纯化及理化性质研究桑黄子实体经95％乙醇脱脂后，依次经过沸水、碱液提取，得到水溶粗多糖PBF30、PBF60、PBF80，碱提水溶性多糖PBFA1和碱提水不溶性多糖PBFA2五个粗多糖组分。水提粗多糖总得率为4.52％，碱提水溶性多糖PBFA1得率为3.08％，碱提水不溶性多糖PBFA2得率较低（1.08％）。粗多糖经阴离子交换层析（DEAESepharoseFastFlow）和凝胶柱（SephacrylS系列材料）层析获得六个组分PBF2-PBF7。紫外全扫描检测PBF2-PBF6不含蛋白质和核酸，Lowry法测定PBF7含0.53％蛋白质。通过高效液相色谱检测为均一组分，其分子量分别为2.0×106Da、2.3×105Da、1.41×106Da、1.74×106Da、3.23×105Da和1.42×104Da。 2.桑黄子实体均一多糖的结构鉴定通过各种分析方法，如糖组成分析、糖残基连接方式分析、红外光谱分析、核磁共振（一维：1HNMR，13CNMR，二维：1H-1HCOSY谱、TOCSY谱、HMQC谱、NOESY谱和HMBC谱）等，研究了桑黄均一多糖的化学结构。 1.PBF2的结构分析糖组成分析结果表明PBF2含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖，其摩尔比为1.0：2.3：10.7。甲基化分析结果表明，岩藻糖以端基形式存在，甘露糖以1，3，6-连接方式存在，葡萄糖主要以1，6-和1，3，6-两种方式连接，还有少量的以端基形式存在。由核磁共振进一步分析结果表明PBF2以β-1，6-Glcp为主链，在β-1，3，6-Glcp的3位产生支链，α-L-Fucp位于β-1，3，6-Glcp的3位上。端基由葡萄糖组成，同时还含有少量的（1→3，6）-β-D-Manp残基。 2.PBF3的结构分析糖组成分析结果表明PBF3仅由葡萄糖组成。甲基化分析结果显示，葡萄糖残基有四种连接方式，分别为1，3-、1，4-、1，3，6-和末端连接，摩尔比为2：4：1：1。由核磁共振进一步分析表明，PBF3是一个以1，4和1，3连接的葡萄糖为主链的多糖，在→3，6）-β-D-Glcp-（1→的3位产生支链，端基β-D-Glcp位于β-1，3，6-Glcp的6位上。 3.PBF4的结构分析糖组成分析结果表明PBF4含有岩藻糖和葡萄糖两种单糖，其摩尔比为1：4。甲基化分析结果表明，岩藻糖以1，2-方式连接，葡萄糖主要以1，4-、1，4，6-和端基的形式连接。由核磁共振进一步分析，PBF4的主要结构重复单元为：→4）-α-D-Glcp-（1→2）-α-L-Fucp（1→4）-α-D-Glcp-（1→同时还含有少量的β-1，4，6-Glcp，端基由Glcp组成。 4.PBF5的结构分析糖组成分析结果表明PBF5含有甘露糖和葡萄糖两种单糖，其摩尔比为1：5，糖醛酸含量为6.5％。甲基化分析结果表明，甘露糖以1，4-连接方式存在，葡萄糖以1，4-、1，3，4-和末端连接三种连接方式存在，四种糖残基的比例分别为1.0：3.6：0.4：1.0。由核磁共振进一步分析表明，PBF5是以α-1，4-Glcp和β-1，4-Manp为主链的，葡萄糖末端通过α-1，3，4-连接的葡萄糖的3位连接在主链上，其具体重复单元的结构为： 5.PBF6的结构分析糖组成分析结果表明PBF6仅含有葡萄糖一种单糖。甲基化分析结果表明，葡萄糖主要以1，6和1，3两种形式存在，摩尔比为1：2。由核磁共振进一步分析表明，其主链是以β-1，3-Glcp和β-1，6-Glcp构成的，主链结构如下： →3）-β-D-Glcp-（1→3）-β-D-Glcp-（1→6）-β-D-Glcp-（1→ 6.PBF7的结构分析糖组成分析结果表明PBF7由葡萄糖组成，糖醛酸含量为10.51％。甲基化分析结果表明，葡萄糖主要以1，6和1，3两种形式存在，摩尔比为1：1。由核磁共振进一步分析表明，PBF7是以β-1，3葡萄糖和β-1，6葡萄糖为主链的葡聚糖。 3硫酸酯化桑黄多糖的结构和构象研究利用碱提醇沉法从桑黄子实体中获得碱提水不溶性多糖PBFA2，三氧化硫-吡啶法对其进行硫酸化修饰后，制得能溶于水的硫酸化桑黄多糖。经DEAE-SepharoseF.F.离子交换柱层析和SephacrylS-400凝胶柱层析得到纯多糖SPBFA，相对分子量为1.28×104Da，硫酸基质量分数为14.7％，取代度为1.40。红外光谱显示，在波数1240cm-1、810cm-1处有硫酸酯键的特征吸收峰。糖组成分析表明SPBFA仅由葡萄糖组成，甲基化分析得葡萄糖主要由1，3-和端基两种方式连接；核磁共振进一步分析表明，SPBFA为水溶性的α-（1→3）-D-葡聚糖。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：名词缩写

声明

第一章文献综述

1.1桑黄的研究概况

1.1.1桑黄的生物学特性

1.1.2桑黄的化学成分

1.1.3桑黄多糖的药理作用

1.1.4桑黄多糖的提取、分离纯化及结构分析

1.2真菌多糖结构修饰及鉴定研究进展

1.2.1多糖分子修饰方法

1.2.2结构修饰多糖的波谱学方法鉴定

1.2.3展望

1.3本课题研究目的、意义及主要研究内容和预期目标

1.3.1本课题研究目的、意义

1.3.2研究内容

1.3.3预期目标

第二章 桑黄子实体多糖分离纯化及理化性质研究

2.1材料和仪器

2.1.1实验材料

2.1.2实验试剂

2.1.3主要仪器

2.2实验方法

2.2.1多糖的提取工艺

2.2.2粗多糖含量的测定

2.2.3蛋白的测定

2.2.4粗多糖的分离纯化

2.2.5多糖的纯度及分子量测定

2.2.6紫外光谱(UV)的检测

2.3结果与分析

2.3.1桑黄子实体粗多糖的提取分离

2.3.2桑黄子实体提取物中多糖含量的测定

2.3.3多糖的分离纯化

2.3.4多糖纯度及分子量测定

2.3.5多糖的紫外光谱分析

2.4本章小结

第三章桑黄子实体多糖的结构研究

3.1材料与仪器

3.1.1实验材料

3.1.2实验试剂

3.1.3实验仪器

3.2实验方法

3.2.1单糖组成分析

3.2.2糖残基连接方式分析

3.2.3糖醛酸的测定

3.2.4红外光谱分析

3.2.5核磁共振分析

3.2.6刚果红实验

3.3结果与分析

3.3.1 PBF2的结构分析

3.3.2 PBF3的结构分析

3.3.3 PBF4的结构分析

3.3.4 PBF5的结构分析

3.3.5 PBF6的结构分析

3.3.6 PBF7的结构分析

3.3.7刚果红实验

3.4本章小结

第四章桑黄多糖硫酸酯化分子修饰的研究

4.1材料与仪器

4.1.1实验材料

4.1.2实验试剂

4.1.3实验仪器

4.2实验方法

4.2.1碱提水不溶性多糖的制备

4.2.2多糖的硫酸酯化反应

4.2.3硫酸酯化多糖的纯化

4.2.4硫酸基含量的测定：BaCl2-明胶比浊法

4.2.5紫外光谱分析

4.2.6红外光谱分析

4.2.7单糖组成分析

4.2.8甲基化分析

4.2.9 NMR分析

4.2.10刚果红实验

4.3结果与分析

4.3.1 SPBFA的分离纯化结果

4.3.2硫酸基含量和取代度

4.3.3紫外光谱分析

4.3.4红外光谱分析

4.3.5糖组成分析

4.3.6甲基化反应

4.3.7核磁共振结果分析

4.3.8刚果红实验

4.4本章小结

第五章讨论和全文总结

参考文献

附录1

附录2

附录3

附录4

攻读博士学位期间发表论文情况

致谢