游离放线菌发酵废渣中肽聚糖的提取、纯化与活性研究

摘要

游动放线菌Actinoplanes sp.常用于发酵制备降糖药物-阿卡波糖，生产后会产生大量的固体废渣，需要委托环保部门进行处理。然而，这些废渣中含有较多未被利用的活性成分，因此，开发废渣中有效成分的高效提取方法，进行资源再利用具有重要的研究价值。本文主要围绕游动放线菌发酵废渣中肽聚糖的提取方法、分离纯化及生物活性研究等方面展开研究，以期为生物制药废弃物的可再生利用提供理论依据。
　　1)以阿卡波糖药物生产后的废渣为研究材料，在单因素实验的基础上通过响应面法优化磷壁酸去除方法，最佳工艺条件为加碱量6％(m碱/m菌泥=0.06)，球料比15，转速300rpm，球磨时间5min。采用正交实验优化蛋白质去除方法，最佳工艺条件为转速300rpm，SDS添加量17％，球料比15，球磨时间30min。最终获得一条操作简单、时间短、成本低的肽聚糖提取路线。所得提取物经溶菌酶溶解实验、红外光谱检测、化学成分分析等证实为肽聚糖。
　　2)以第一部分中所得提取物为原料，通过酶解和纯化获得可溶性肽聚糖组分SPG-1。对组分SPG-1进行免疫及抗肿瘤活性研究，结果如下:大鼠脾淋巴细胞增殖实验显示SPG-1对T、B淋巴细胞均具有明显增殖效果;巨噬细胞体外刺激实验显示可溶肽聚糖片段通过刺激巨噬细胞产生IL-10、IL-12、TNF-α因子从而起到免疫刺激作用;抗肿瘤实验结果显示SPG-1对HT29结肠癌细胞、Eca-109食道癌细胞和HepG2肝癌细胞均有较好的抑制作用。

目录

声明

致谢

摘要

主要缩略词简表(Abbreviations)

第一章 绪论

1．1 阿卡波糖发酵菌渣处理方法介绍

1．2 放线菌的研究进展

1．3 细菌细胞壁肽聚糖(PG)的研究进展

1．3．1 肽聚糖的特性

1．3．2 PG的提取

1．3．3 PG的生物活性和功能

1．4 课题设计及研究意义

第二章 肽聚糖的提取工艺研究及组分分析

前言

2．1 实验材料

2．1．1 仪器与试剂

2．1．2 放线菌肽聚糖(PG)的菌渣的预处理

2．2 去除磷壁酸方法的研究

2．2．1 传统溶液法去除磷壁酸

2．2．3 菌渣肽聚糖磷壁酸去除率的测定

2．2．4 菌渣肽聚糖破坏程度检测

2．3 去除蛋白质方法的研究

2．3．1 传统溶液法去除蛋白质

2．3．3 上清液中蛋白质含量检测

2．4 传统溶液法与机械球磨法提取肽聚糖总路线

2．5 放线菌肽聚糖的初步鉴定和相关分析

2．5．1 溶菌酶消化实验

2．5．2 氨基酸组分分析实验

2．5．3 红外光谱分析

2．5．4 肽聚糖提取物化学成分分析

2．6 结果与讨论

2．6．1 传统溶液法去除磷璧酸研究

2．6．2 机械球磨法去除磷壁酸单因素实验

2．6．3 机械球磨法去除磷壁酸响应面结果

2．6．4 传统溶液法去除蛋白质研究

2．6．5 机械球磨法去除蛋白质研究

2．6．6 传统溶液法与机械球磨法工艺比较

2．6．7 溶菌酶消化实验

2．6．8 氨基酸组分分析

2．5．9 红外光谱分析

2．6．10 肽聚糖提取物化学成分分析

本章小结

第三章 肽聚糖可溶性片段分离纯化与生物活性研究

前言

3．1 主要实验材料及仪器

3．2 HPLC液相条件及半制备液相条件

3．3 可溶性肽聚糖(SPG)提取时间的研究

3．4 SPG组分分析与制备

3．5 SPG组分的脱盐纯化

3．6 SPG-1对鼠免疫活性影响实验

3．6．1 SPG-1对鼠脾脏淋巴细胞的增殖影响

3．6．2 SPG-1对鼠巨噬细胞的体外免疫刺激实验

3．7 SPG-1对肿瘤细胞抑制试验

3．8 数据统计

3．9 结果与讨论

3．9．1 溶菌酶酶解时间的研究

3．9．2 SPG组分分析与制备

3．9．3 SPG-1组分的脱盐纯化

3．9．4 SPG-1对鼠脾脏淋巴细胞的增殖研究

3．9．5 SPG-1对巨噬细胞体外刺激研究

3．9．6 SPG-1对raw264．7 细胞产生细胞因子效果

3．9．7 SPG-1对A549、HT29、Eca-109、对HepG2癌细胞的抑制效罘

本章小结

总结与展望

参考文献

硕士期间发表的论文和专利