益生菌芽孢乳酸菌对养殖大黄鱼贮藏过程中品质的影响研究

摘要

大黄鱼是我国主要的经济养殖鱼类之一，同时也是重要的出口水产品。但是由于养殖大黄鱼肌肉蛋白质含量高，极易受到腐败菌及内源性蛋白酶的作用，导致其在贮藏过程中极易发生降解和变性，最终导致鱼肉新鲜度的下降，影响大黄鱼的经济价值。因此，如何在保证养殖大黄鱼品质的同时抑制鱼肉主要腐败菌的生长最终达到延长其货架期已经成为目前亟需解决的课题。
　　鉴于此，本文以益生菌芽孢乳酸菌为生物保鲜剂，首先研究了该菌对水产品中典型腐败菌的抑制效果，随后通过感官评价、理化指标检测以及PCR-DGGE技术综合评价了芽孢乳酸菌对养殖大黄鱼在贮藏过程中品质的变化。此外，分析了芽孢乳酸菌处理对养殖大黄鱼蛋白质生化特性的影响，从蛋白质变性和降解的角度探究了芽孢乳酸菌的作用机制。研究得到的主要结果如下:
　　1、芽孢乳酸菌胞外产物对水产品中典型腐败菌大肠杆菌、腐败希瓦氏菌、假单胞菌具有较强的抑菌性。其中，胞外产物对热不敏感具有较强的稳定性;酸性条件和弱碱性条件下均表现出较强的抑菌性，而当pH＜2.0或pH＞8.0条件下抑菌活性受到显著的影响;此外，过氧化氢酶和胃蛋白酶处理后与对照组差异不显著，其中过氧化氢酶处理后其抑菌性仍能保留在88％左右;蛋白酶K和胰蛋白酶处理以后，其抑菌性仅剩下50％左右，与对照组相比差异显著。同时，研究结果显示芽孢乳酸菌初始pH值6.0，37℃有氧条件培养48 h后，对腐败指示菌的抑制活性效果最佳。
　　2、贮藏过程中不同浓度的益生菌芽孢乳酸菌(T-1，1×108 cfu/mL;T-2，1×107 cfu/mL;T-3，1×106 cfu/mL)对养殖大黄鱼具有显著的影响。与对照组比较分析结果显示，处理组pH值、硫代巴比妥酸(TBA)值、挥发性盐基氮(TVB-N)值以及K值相对较低;其中处理组pH值与硫代巴比妥酸(TBA)较对照组差异不显著（P＞0.05）;挥发性盐基氮(TVB-N)值差异显著（P＜0.05），贮藏前12 d内处理组之间的差异不显著（P＞0.05）;K值处理组与对照组之间差异显著(P＜0.05)，而处理组之间的差异不显著(P＞0.05);且不同浓度芽孢乳酸菌处理的样品感官评分优于对照组。因此，贮藏过程中，芽孢乳酸菌具有较强的抑菌性和抗氧化性，其中处理组T-2保鲜效果较好，可延长养殖大黄鱼货架期4d左右。
　　3、建立养殖大黄鱼在贮藏过程中菌群的动态变化的PCR-DGGE检测技术，分析获得22种不同的细菌。结果表明养殖大黄鱼在贮藏过程中存在的细菌主要是希瓦氏菌(Shewanella)，发光杆菌(Photobacterium)，假单胞菌(Pseudomonas)，气单胞菌(Aeromonas)，副溶血弧菌(Vibrio sp)，Aliivibrio，变形细菌（Proteobacterium)，其中主要腐败菌是希瓦氏菌，占总体菌落的50％以上。应用同样的技术，研究了芽孢乳酸菌对养殖大黄鱼贮藏过程中菌群的影响，结果显示芽孢乳酸菌能够有效的抑制部分希瓦氏菌、假单胞菌、气单胞菌、副溶血弧菌的生长，而其不能完全抑制发光杆菌、希瓦氏菌、Aliivibrio和变形细菌的生长。
　　4、分析在贮藏下不同浓度芽孢乳酸菌处理对养殖大黄鱼色差、质构、肌原纤维蛋白的盐溶性、Ca2+-ATPase活性、巯基含量、蛋白表面疏水性、SDS-PAGE凝胶电泳及肌肉的微观组织结构等指标的影响。结果表明:芽孢乳酸菌处理养殖大黄鱼减缓了肌原纤维蛋白的降解速度，其中色差变化差异不显著（P＞0.05）;质构结果表明处理组硬度相对高，差异显著(P＜0.05)，且处理组T-2与T-1和T-3之间差异显著(P＜0.05);处理组肌原纤维蛋白盐溶性、巯基含量和Ca2+-ATPase活性下降速率与对照组差异显著（P＜0.05），且蛋白表面疏水性上升速率与对照组差异显著(P＜0.05);SDS-PAGE结果显示，处理组显著的延缓了肌球蛋白重链的降解;另外，根据肌肉微观组织结构图片显示，芽孢乳酸菌处理后肌肉的肌纤维面积比例显著减少，肌节间隙面积比也明显增大。因此，芽孢乳酸菌能够有效的抑制肌纤维的降解和组织结构的劣变，延缓肌肉质地软化，其中菌液浓度为1×107 cfu/mL处理后效果最好。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 养殖大黄鱼简介

1．2 水产品保鲜技术概述

1．3 芽孢乳酸菌介绍

1．4 微生物源防腐剂介绍

1．4．1 乳酸链球菌素

1．4．2 纳他霉素

1．4．3 ε-聚赖氨酸

1．5 贮藏过程中鱼类组织蛋白理化性质变化

1．5．1 鱼肉死后腐败过程

1．5．2 贮藏过程中蛋白质的变化

1．5．3 贮藏过程中肌肉组织结构的变化

1．6 PCR-DGGE技术在食品微生物学中的应用

1．6．1 PCR-DGGE技术

1．6．2 PCR-DGGE技术优缺点

1．7 研究意义及内容

1．7．1 研究意义

1．7．2 研究内容

第2章 益生菌芽孢乳酸菌理化特性及胞外产物抑菌活性研究

2．1 材料与仪器

2．1．1 材料

2．1．2 主要仪器和设备

2．2 试验方法

2．2．1 菌种活化及培养

2．2．2 芽孢乳酸菌菌落形态观察

2．2．3 不同初始条件对指示菌抑菌效果的研究

2．2．4 不同处理条件对指示菌抑菌效果的研究

2．2．5 抑菌效果的测定

2．3 结果与分析

2．3．1 芽孢乳酸菌菌落形态、培养特征以及菌体形态学观察

2．3．2 不同培养时间对抑菌效果的研究

2．3．3 不同初始pH值和温度对抑菌效果的研究

2．3．4 不同温度及pH处理条件对抑菌效果的研究

2．3．5 不同蛋白酶处理条件对抑菌效果的研究

2．4 本章小结

第3章 芽孢乳酸菌对养殖大黄鱼保鲜效果的研究

3．1 试验材料与仪器

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验仪器

3．2 试验方法

3．2．1 样品处理

3．2．2 指标测定

3．2．3 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 养殖大黄鱼在保鲜过程中pH的变化

3．3．2 养殖大黄鱼在贮藏过程中挥发性盐基氮(TVB-N)变化

3．3．3 养殖大黄鱼在保鲜过程中K值的变化

3．3．4 养殖大黄鱼在保鲜过程中TBA值的变化

3．3．5 养殖大黄鱼在保鲜过程菌落总数的变化

3．3．6 不同浓度芽孢乳酸菌对特定腐败菌的影响

3．3．7 不同浓度芽孢乳酸菌对养殖大黄鱼感官评分的影响

3．4 本章小结

第4章 芽孢乳酸菌影响贮藏过程中养殖大黄鱼体表菌相的研究

4．1 试验材料与仪器

4．1．1 试验材料

4．1．2 实验仪器

4．1．3 主要工作液配方

4．2 试验方法

4．2．1 样品处理

4．2．2 养殖大黄鱼表面微生物总基因组DNA的提取

4．2．3 PCR扩增

4．2．4 PCR-DGGE电泳

4．2．5 DGGE清晰条带的割胶、回收DNA

4．2．6 数据处理

4．3 结果与分析

4．3．1 养殖大黄鱼样品细菌总DNA的PCR扩增结果

4．3．2 DGGE图谱分析

4．3．3 样品多样性指数分析

4．3．4 UPGMA聚类分析

4．3．5 主成分分析

4．3．6 测序结果信息学分析

4．4 本章小结

第5章 芽孢乳酸菌影响养殖大黄鱼贮藏品质变化的机制探究

5．1 试验材料与仪器

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验仪器

5．2 试验方法

5．2．1 样品处理

5．2．2 物理指标

5．2．3 鱼肉肌原纤维蛋白的提取及定量

5．2．4 Ca2+-ATPase活性测定

5．2．5 巯基含量测定

5．2．6 肌原纤维蛋白表面疏水性测定

5．2．7 肌肉组织微观结构观察

5．2．8 SDS-PAGE电泳

5．2．9 数据处理

5．3 结果与分析

5．3．1 物理变化

5．3．2 肌原纤维蛋白盐溶性变化

5．3．3 Ca2+-ATPase活性的变化

5．3．4 巯基含量的变化

5．3．5 鱼肉蛋白表面疏水性的变化

5．3．6 肌肉组织微观结构的变化

5．3．7 SDS-PAGE电泳分析

5．4 本章小结

第6章 总结论、创新点与展望

6．1 总结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附录

致谢

硕士期间完成的论文

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