新型凝集载体的研制及其在食品安全快速检测中的初步应用

摘要

食品安全历来是人们关注的的焦点问题，而食源性致病菌引起的公共卫生安全问题是食品安全最大的隐患之一。对食源性致病菌的检测技术主要分为传统检测技术和现代快速检测技术，现代快速检测技术因具有快速、简便、成本低、准确性高等优点而备受关注。间接凝集试验作为现代快速检测技术的一种，能够快速简便的实现对致病菌的快速检测，因而被广泛应用于细菌学诊断。具有操作简便、凝集现象直观、致敏颗粒易保存、快速、无须借助高端仪器辅助检测，检测条件要求低等优点而深受各种检测机构的亲睐。载体是间接凝集试验所必需的，也是凝集效果的关键影响因素。目前用于间接凝集试验的主要有动物或人的红细胞制备而成的红细胞载体颗粒、活性炭粒载体、聚苯乙烯胶乳颗粒载体和明胶颗粒载体等。红细胞作为载体颗粒，其大小均一，主要有绵羊、鸡及家兔的红细胞或O型人红细胞。吸附的抗原类型主要是多糖类抗原，而蛋白质抗原或抗体的吸附能力相对较差。红细胞致敏后出现易溶血、变脆、污染等问题，对使用时间要求严格，通常必须在2-3天内使用，红细胞的稳定性较差，保存时间短。聚苯乙烯胶乳是一种人工合成的载体，粒径约为0.8um的球形颗粒，均一性好，表面带有负电荷，主要通过物理吸附的方式结合蛋白质，但这种吸附结合方式牢固性较差，抗体或抗原易于从聚苯乙烯胶乳上脱落，自身的物理化学性质也较为脆弱，容易受到各种理化因素的影响而出现自凝现象，最终导致凝集结果的误判。而且这两种常用的载体颜色单一，凝集显现出来的凝集块颜色也单一，依赖于自身所具有的颜色限制，在凝集过程中不能最大程度的放大反应信号，因此，选择一种性能优异，稳定性好，易于染料修饰、能够满足各种需求的载体就显得尤为重要。二氧化硅微球(Silica Microspheres，SMSs)因其尺寸易于控制，稳定性强，生物相容性好，不易发生溶胀及保存期长等独特优势而引起科研工作者的极大重视。二氧化硅微球本身无色，用于间接凝集试验并不能有效的放大反应信号。为了克服这个缺点，对微球表面进行修饰，由于二氧化硅微球表面含有大量羟基或不饱和残键，易于功能化，使得存在进行表面染料修饰的可能，这样。获得的微球在不影响自身性质的同时又具有鲜艳的色泽，能够最大程度的放大凝集信号，使凝集现象更加明显、直观。有机活性染料，分子中含有化学性活泼的基团，在水溶液中可以通过共价结合的方式与棉、毛等纤维等反应形成共价复合物。活性染料分子在结构上可以分为染料母体和活性基团两个主要部分，活性染料的发色结构是染料母体，赋予染料不同色泽。活性基团是染料分子与纤维直接其反应的基团，不同活性基团可以以不同方式与羟基进行反应。因此，从化学的角度来看，活性染料如此多的种类和良好的化学反应活性使得它非常适合对二氧化硅微球进行染色。因此，将有机活性染料以稳定的共价键修饰到微球表面，使微球着上鲜艳明亮的色泽，将能更有助于反应信号的放大和获得更加明显的反应现象。
　　综上所示，本研究将尝试通过反相微乳法合成纳米级SiNps和半连续Stober法合成微米级SMSs，通过化学修饰的方式对微球表面进行染料修饰，以硅烷偶联剂为媒介通过共价键结合到微球表面，制备得Colored-SiNps和Colored-SMSs。再将制备得的彩色微球通过生物偶联技术修饰上抗体，使具备免疫活性。并以彩色二氧化硅微球为载体构建新型凝集技术用于食品中致病微生物的快速检测，活性染料赋予了微球鲜艳的色彩，放大了凝集信号，使凝集现象更加醒目、直观。本论文将主要从以下几个方面探究了该新型凝集技术对致病菌和病毒的凝集性能，并优化了凝集条件。
　　1基于Colored-SiNps微载体的新型凝集技术的凝集性能探究
　　为探究一种性能优良的间接凝集试验载体，本研究将尝试通过反相微乳法合成SiNPs，对SiNps表面进行活性大红3G染料修饰，并优化了染料的偶联条件，制备得Red-SiNps，SEM表征Red-SiNps的形貌和粒径。Nano2S激光粒度电位仪表征抗体修饰前后Red-SiNps的粒径和电位变化，最后以此建立基于IgG-red-SiNps为载体的新型凝集技术，分别修饰上三种不同抗体与对应菌或病毒分别在U型反应板、V型反应板和凹圆载玻片凝集，用数码相机对凝集结果进行表征。结果表明:Red-SiNps粒径均一规则，粒径分布范围窄，性能稳定，单分散性好，颗粒颜色丰富，色泽选择范围广。该研究不仅说明基于Colored-SiNps为载体的新型凝集技术在U型反应板、V型反应板和凹圆载玻片上的凝集性能优异，特异性强，快速，准确度高。而且也说明了基于IgG-red-SiNps为载体的新型凝集技术在这些反应器中既对细菌如鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌和阪崎肠杆菌的凝集性能优异，对病毒如EDSV也有非常好的凝集性能。
　　2基于Colored-SiNps微载体同时快速检测两种致病菌的新型凝集技术
　　基于Colored-SiNps为载体的新型凝集技术对于单种菌的凝集已经显示出了优异的凝集性能和巨大优势，那么利用染料和SiO2易修饰的优点探究该新型凝集技术对两种致病菌的同时凝集就显得尤为必要，因此，本研究旨在以阪崎肠杆菌和鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌为凝集对象，探究一种同时与阪崎肠杆菌和鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌混合液发生凝集反应且呈现出两种不同颜色凝集现象的新型凝集技术。结果表明:基于IgG-red-SiNps和IgG-blue-SiNps为载体的新型凝集技术在对不同浓度鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌和等量生理盐水的混合溶液凝集过程中，IgG-blue-SiNps只与对应的鸡白痢鸡伤寒沙门菌发生特异性凝集，出现了蓝色凝集块，且凝集现象随着鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌浓度的降低而有所减弱。修饰有板崎肠杆菌抗体的IgG-red-SiNps因没有对应菌与之凝集而均匀分散在液滴中，无红色凝集块出现。在与不同浓度阪崎肠杆菌和生理盐水的混合液凝集中，也出现上述相同结果。而该新型凝集技术在与一种菌浓度固定另一种菌浓度变化的混合菌液混合后凝集，会同时出现两种分别为红色和蓝色的凝集块，其中，菌液浓度固定的凝集块大小不变，而浓度变化的菌液的凝集现象则随着浓度的稀释而逐渐减弱。在两种菌的同时凝集过程中，凝集时间仅需20-30s，准确性好，特异性好，可靠性强，过程简便，凝集结果明显、肉眼可观，并且无交叉反应。因此，基于SiNps为载体对两种致病菌的同时凝集技术具有灵敏、经济、稳定、简便、快速、准确等优点。
　　3基于Yellow-SiNps微载体快速检测EDSV的新型凝集技术
　　本论文中已实现对单种致病菌和两种致病菌的同时凝集，为了拓展基于SiNps载体新型凝集技术在病毒领域的检测应用，拟探究一种新型凝集技术检测鸡减蛋综合征病毒(Egg drop syndromeviruses，EDSV)。本研究以Yellow-SiNps为间接凝集试验的载体，表面修饰EDS-76病毒的抗体，构建了一种基于免疫活性二氧化硅纳米颗粒(Immuneyellow silica nanoparticles，IgG-yellow-SiNps)微载体的快速检测EDSV的新型凝集技术。结果表明，该新型凝集技术过程简便，凝集现象明显、肉眼可观，特异性好，无交叉反应。对目标菌溶液的检测限是103～109cfu·mL-1，载体Yellow-SiNps对凝集结果无干扰、并能放大凝集反应信号，说明基于yellow-SiNps为载体的新型凝集技术在检测病毒方面也具有灵敏、稳定、简便、快速、准确、经济、等优点，适用于病毒的凝集检测，并且凝集性能优异。
　　4单分散微米级二氧化硅微球的制备研究
　　通过对纳米级二氧化硅微粒新型凝集技术的研究表明基于纳米级二氧化硅微粒为载体构建的新型凝集技术在检测单种菌和病毒或同时检测两种菌都具有良好的凝集性能，在此基础上，拟通过增大SiO2微粒的粒径再次实现凝集信号的放大，并探究微米级SiO2微球(Micrometer-Sized Silica Microspheres)对食源性致病菌的凝集性能。因此，本试验通过半连续Stober法制备微米级SiO2微球(Silicamicrospheres，SMSs)，并用活性大红3G对微球表明进行了修饰，探究了微米级SMSs的合成和染色机理。结果表明:通过半连续Stober法合成的微米级SMSs粒径均一、形状规则，具有鲜艳的色泽，粒径分布范围窄。
　　5基于Red-SMSs微载体快速检测阪崎肠杆菌的新型凝集技术
　　通过半连续Stober法合成了微米级SMSs，拟以此建立一种基于微米级二氧化硅微球为载体快速检测食源性致病菌的新型间接凝集技术，探究该新型凝集技术对阪崎肠杆菌的凝集性能。结果表明:基于Red-SMSs为载体的新型凝集技术，特异性好，无交叉反应;Red-SMSs的色泽鲜艳，使其凝集结果更加醒目，易于判断;在4℃条件下能保藏近30天，稳定性强，生物相容性好;对目标菌的检测限为103cfu·mL-1-109 cfu·mL-1。基于微米级二氧化硅为载体构建的新型凝集技术具有特异性好，稳定、结易于判定、载体颜色可选、快速、简便、经济等优点，相对于纳米级SiNps为载体的凝集试验具有明显的凝集现象。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 食品安全及病原微生物

1．2 致病微生物检测现状

1．3 阪崎肠杆菌的危害及其检测现状

1．4 鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌的危害及检测现状

1．5 鸡减蛋综合症病毒

1．6 间接凝集试验

1．7 载体

1．7．1 红细胞载体

1．7．2 聚苯乙烯胶乳载体

1．7．3 炭颗粒载体

1．8 二氧化硅微粒

1．9 有机活性染料

1．10 彩色微球的制备技术

1．11 微球的生物偶联改性

1．12 本论文的研究意义、目的与创新性

1．12．1 研究意义

1．12．2 研究目的

1．12．3 创新性

第2章 基于Red-SiNps微载体的新型凝集技术的凝集性能探究

2．1 材料与方法

2．1．1 仪器与设备

2．1．2 材料与试剂

2．1．3 Colored-SiNps的制备

2．1．4 IgG-red-SiNps的制备

2．1．5 Red-SiNps的表征

2．1．6 染料吸收光谱标准曲线

2．1．7 偶联时间对染料偶联率的影响

2．1．8 Red-SiNps的紫外可见吸收光谱和偶联剂对染料偶联率的影响

2．1．9 抗体修饰前后的表征

2．1．10 凝集试验方法选择

2．1．11 纯抗体与IgG-red-SiNps的凝集信号对比

2．2 结果与讨论

2．2．1 Red-SiNps的制备与表征

2．2．2 偶联时间对偶联率的影响

2．2．3 Red-SiNps稳定性

2．2．4 偶联剂对Red-SiNps的吸收光谱和染料偶联率的影响

2．2．5 IgG-red-SiNps在U型反应板中的凝集性能

2．2．6 IgG-red-SiNps在V型反应板中的凝集性能

2．2．7 IgG-red-SiNps在凹载玻片上的凝集性能

2．2．8 纯抗体和IgG-red-SiNps与对应菌凝集对比

2．3 小结

第3章 同时快速检测两种致病菌的新型凝集技术研究

3．1 材料和方法

3．1．1 仪器与设备

3．1．2 材料与试剂

3．1．3 Red-SiNPs和Blue-SiNps的制备

3．1．4 Red-SiNPs和Blue-SiNps的表征

3．1．5 IgG-Colored-SiNps的制备

3．1．6 IgG-red-SiNPs和IgG-blue-SiNps的特异性试验

3．1．7 IgG-red-SiNPs和IgG-blue-SiNps最佳凝集浓度选择

3．1．8 IgG-Colored-SiNps与两种菌的凝集试验

3．1．9 稳定性凝集试验

3．1．10 IgG-colored-SiNps在复杂体系实际样品中的凝集试验

3．2 结果

3．2．1 Color-SiNps表征

3．2．2 Colored-SiNps的稳定性

3．2．3 两种染料的选择

3．2．4 紫外吸收光谱

3．2．5 IgG-colored-SiNps的特异性试验

3．2．6 IgG-Colored-SiNps凝集结果的显微摄像表征

3．2．7 IgG-colored-SiNps最适凝集浓度的选择

3．2．8 IgG-colored-SiNps稳定性分析

3．2．9 IgG-colored-SiNps与两种菌的凝集试验

3．2．10 IgG-colored-SiNps在复杂体系实际样品中的凝集反应

3．3 小结

第4章 基于IgG-yellow-SiNps微载体快速检测EDSV的新型凝集技术

4．1 材料和方法

4．1．1 仪器与设备

4．1．2 材料与试剂

4．1．3 IgG-yellow-SiNps的制备和表征

4．1．4 IgG-yellow-SiNps的制备

4．1．5 基于Yellow-SiNps为载体的新型凝集技术的构建

4．2 结果与分析

4．2．1 Yellow-SiNps形貌的表征

4．2．2 C．I．活性嫩黄160和Yellow-SiNps的吸收光谱

4．2．3 不同颜色IgG-Yellow-SiNps的凝集试验

4．2．4 IgG-Yellow-SiNps的特异性凝集试验

4．2．5 IgG-Yellow-SiNps敏感性凝集试验

4．2．6 IgG-yellow-SiNps的稳定性试验

4．2．7 最适凝集温度选择

4．2．8 最适凝集浓度比例选择试验

4．3 小结

第5章 单分散微米级二氧化硅微球的制备研究

5．1 材料和方法

5．1．1 仪器与设备

5．1．2 材料与试剂

5．1．3 SMSs的制备

5．1．4 二氧化硅微球的染色

5．2 结果与讨论

5．2．1 SMSs反应机理

5．2．2 SMSs染色机理

5．2．3 SMSs色彩的多样性

5．2．4 二氧化硅微球的表征

5．2．5 粒径和Zeta电位

5．2．6 有机活性大红136和Red-SM的紫外可见光谱

5．3 结论

第6章 基于微米级Red-SMSs为载体快速检测阪崎肠杆菌的新型凝集技术

6．1 材料和方法

6．1．1 仪器与设备

6．1．2 材料与试剂

6．1．3 载体IgG-red-SMSs的制备

6．1．4 基于Red-SMSs微载体的新型凝集技术检测阪崎肠杆菌

6．2 结果与讨论

6．2．1 微球的Zeta电位与SMSs在载玻片上状态

6．2．2 IgG-red-SMSs特异性试验

6．2．3 IgG-red-SMSs灵敏度试验

6．2．4 IgG-red-SMSs的稳定性试验

6．2．5 最适反应温度选择

6．3 小结

第7章 课题总结及展望

7．1 课题总结

7．2 课题展望

参考文献

附录

致谢

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