层孔菌发酵菌粉的新药材研制及其活性成分Hispolon的抗肿瘤分子机制研究

摘要

层孔菌是属于多孔菌科的一类真菌。在我国民间许多层孔菌(如裂蹄层孔菌,木蹄层孔菌,松针层孔菌等)历来作为药用,广泛用于治疗胃肠道疾病,胃溃疡,炎症,淋巴性疾病以及胃癌、肝癌、结肠癌等多种癌症。但是古代医书和民间药方对这些层孔菌的描述比较笼统,缺乏药效成分、功能定位和作用机理的阐述,并且由于野生环境不断受到破坏,导致这些药用真菌资源锐减,许多品种已濒临灭绝,很难人工采集到。因此如何保护药用真菌这一资源,并利用现代生物技术深入发展和利用药用真菌,已成为中药现代化的一个主要研究方向。 本论文针对目前药用真菌野生资源缺乏,作用机理不明这两个困扰药用真菌新药创制的主要问题,以层孔菌作为研究对象,通过构建木蹄层孔菌L8的液体深层发酵工艺,解决了人工资源化问题,为深入进行层孔菌药用真菌的新药材研制提供了一种模式；进一步分析了层孔菌抗肿瘤功效的物质基础,确定多酚化合物Hispolon为一些层孔菌中共有的一个活性成分；在此基础上,深入研究了Hispolon的抗肿瘤分子机制,发现Hispolon可以诱导胃癌细胞发生一种特殊的活性氧自由基(ROS)介导的线粒体途径的凋亡,这种凋亡机制至今尚未报道。主要结果如下： 1.通过形态学,生理生化特征,以及ITS序列分析,对实验室前期分离到的层孔菌L8菌株进行了鉴定,确定其为木蹄层孔菌(GeneBank no.DQ 513402)。在明确菌种后,通过反复实验,构建了木蹄层孔菌L8的液体深层发酵培养方法,并优化了其发酵工艺。结果表明当发酵培养基组成为：葡萄糖5％,蚕蛹水解液1％,酵母粉0.5％,KH2PO4 0.05％,MgSO4 0.05％；发酵条件为：温度25℃,初始pH 5.0,转速100 rpm,通气量1.0 vvm,接种体积10％(v/v),发酵周期6天时,层孔菌L8的菌丝生物量最大,可达18.11±1.08 g/L,是优化前的2.3倍。 2.对层孔菌L8的发酵菌粉进行了动物药效学实验,结果表明层孔菌L8的发酵菌粉在剂量为1.5g/kg时对小鼠S180肉瘤有一定的抑制作用,和阴性对照组相比,平均抑瘤率为23.5％(P<0.05);进一步发现该剂量给药组的荷瘤鼠的平均胸腺重量为68.5 mg,显著大于阴性对照组的57.5 mg(P<0.05),而该剂量组荷瘤鼠的平均肝脏重量为230.1 mg,同阴性对照组相当(239.7 mg);相比之下,阳性对照组1.25mg/kg顺铂的抑瘤率虽然高达64.7％,但是同阴性对照组相比,顺铂处理后,荷瘤鼠的胸腺和脾脏的重量都显著下降。另外从给药前后荷瘤鼠的体重变化也可以看出,层孔菌L8的发酵菌粉给药后,荷瘤鼠的体重比给药前都有所增加。以上结果表明层孔菌L8的发酵菌粉,在肿瘤治疗方面,具有潜在的开发价值。 3.采用体外人源的肿瘤细胞作为筛选模型,对10余种层孔菌进行了抗肿瘤活性评价和活性成分的分析,结果发现Hispolon为一些层孔菌中共有的一个活性成分,并发现Hispolon对许多肿瘤细胞表现出剂量依赖性的生长抑制作用,其中对胃癌细胞SGC-7901的活性较好,作用72 h后的ICso低于10μg/mL。 4.利用动态荧光可视技术,流式细胞术,Western-blot等现代肿瘤细胞学和分子药理学的技术和方法,深入研究了Hispolon诱导胃癌细胞死亡的分子机理。结果发现Hispolon可以诱导胃癌细胞发生一种特殊的ROS介导的线粒体途径的凋亡。该凋亡机制如下所述:Hispolon通过将细胞内的GSH驱逐出细胞外,使得细胞内的GSH含量下降；同时抑制细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶GPX的活性,使得胃癌细胞的抗氧化能力大大下降,从而导致ROS的急剧增加。大量的ROS积聚引起了线粒体膜的氧化损伤,破坏了线粒体膜的完整性,导致线粒体膜的通透性增加,使得线粒体中的细胞色素C大量释放出来,激活了Caspase的级联反应,启动凋亡程序,最终引发细胞发生凋亡。相比之下,当Hispolon作用正常的胃粘膜上皮细胞后,ROS并没有显著增加,细胞也没有发生明显的死亡。探索造成这种差异的原因时,我们发现胃癌细胞本身固有的ROS水平比正常的胃上皮细胞要高,这使得胃癌细胞对Hispolon更加敏感。因为胃癌细胞依靠GSH来清除过多的ROS,当Hispolon作用之后,GSH抗氧化系统受到了破坏,严重影响了细胞的抗氧化能力,导致大量的ROS增加,引发了细胞死亡；相比之下,由于正常胃上皮细胞本身固有的ROS水平比较低,当Hisoolon作用后,ROS并没有显著增加,其氧化压力处于细胞所能承受的范围之内,因而细胞没有发生死亡。 5.低剂量的Hispolon(2.5μg/mL)可以显著地增加化疗药物(丝裂霉素C,5-氟尿嘧啶,阿霉素)对胃癌细胞SGC-7901的杀伤性。并且这种增敏机制是通过引发胃癌细胞中的GSH急剧下降,导致了ROS的大量积聚,进而引发了细胞死亡。 综上所述,本论文的研究结果为解决层孔菌类药用真菌的人工资源化问题,深入研究其活性成分的作用机制提供了一种思路和方法,并为层孔菌类药用真菌的新药创制提供了一定的依据。

目录

文摘

英文文摘

第1章绪论

1.1层孔菌的研究现状

1.2天然产物抗肿瘤研究进展

1.3药用真菌产品开发的研究现状

1.4本文的立项依据、研究内容和意义

1.5参考文献

第2章层孔菌发酵菌粉的新药材研制

2.1引言

2.2材料

2.2.1菌株与质粒

2.2.2实验动物

2.2.3瘤株

2.2.4药品和试剂

2.2.5主要仪器

2.3方法

2.3.1层孔菌L8的鉴定

2.3.2层孔菌L8的发酵工艺优化

2.3.3动物药效学实验

2.3.4层孔菌L8的药效成分初步分析

2.3.5数据统计分析

2.4实验结果

2.4.1.层孔菌L8的鉴定

2.4.2发酵工艺的优化结果

2.4.3动物药效学实验的结果

2.4.4层孔菌L8的药效成分的初步分析

2.5讨论

2.6参考文献

第3章层孔菌抗肿瘤活性评价

3.1引言

3.2材料

3.2.1药材

3.2.2细胞系

3.2.3药品和试剂

3.2.4主要实验设备

3.3方法

3.3.1提取物的制备

3.3.2细胞培养

3.3.3体外抗肿瘤活性测定

3.3.4活性成分的分离纯化

3.3.5化合物的结构鉴定

3.3.6数据统计分析

3.4实验结果

3.4.1层孔菌的体外抗肿瘤活性评价

3.4.2活性成分Hispolon的分离鉴定

3.4.3 Hispolon的抗肿瘤活性评价

3.5讨论

3.6参考文献

第4章Hispolon抗肿瘤的分子机制研究

4.1 Hispolon诱导胃癌细胞死亡的分子机理研究

4.1.1引言

4.1.2材料

4.1.3方法

4.1.4实验结果：4.1.4.1Hispolon对肿瘤细胞生长的抑制

4.1.4实验结果：4.1.4.2Hispolon引发了胃癌细胞SGC-7901发生调亡

4.1.4实验结果：4.1.4.3Hispolon诱导了Caspase依赖性的凋亡

4.1.4实验结果：4.1.4.4Hispolon诱导的调亡是通过线粒体途径介导的

4.1.4实验结果：4.1.4.5活性氧自由基(ROS)引发了Hispolon诱导的凋亡

4.1.4实验结果：4.1.4.6Hispolon对GSH抗氧化系统的影响

4.1.4实验结果：4.1.4.7Hispolon对其它胃癌细胞的影响

4.1.5讨论

4.2 Hispolon对化疗药物的增敏作用

4.2.1引言

4.2.2材料

4.2.3方法

4.2.4实验结果

4.2.5讨论

4.3参考文献

第5章结论与展望

本文的创新点

本文的不足及对后续工作的建议

攻读博士学位期间主要的研究成果

致谢