木蹄层孔菌及液体深层发酵制备木蹄层孔菌菌体的方法

摘要

本发明公开了一种木蹄层孔菌及液体深层发酵制备木蹄层孔菌菌体的方法。以大规模液体深层发酵制备木蹄层孔菌菌体为目标。所述木蹄层孔菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.1658，属于担子菌纲(Basidiomycetes)，多孔菌目(Polyporales)，多孔菌科(Polyporaceae)，层孔菌属(Fomes)。本发明以人工分离培养到的木蹄层孔菌为出发菌种，依次经固体斜面培养、摇床种子培养、发酵罐培养，发酵液中的菌丝体以干重计可达10－15g/L。本发明的液体深层通气发酵培养基，营养成分配比合理，能够保证木蹄层孔菌的生长需要，培养基材料丰富，整个分批发酵过程中只需一次配料、一次灭菌即可，具有省时、省工，又减少了由于中途加料造成染菌的机会。

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，涉及一种木蹄层孔菌及液体深层发酵制备木蹄层孔菌菌体的方法。

背景技术

由于野生资源的匮乏和生长环境的恶化，许多名贵药用真菌濒临灭绝，如何挽救这些宝贵的药用资源、满足药物开发需要显得尤为重要，利用微生物技术分离筛选出活性菌株，采用现代发酵技术进行大规模的药材制备很有必要。

木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)是一种名贵中草药，我国东北地区民间使用较为普遍，具有悠久的历史。其子实体内含丰富的萜类、多酚类、生物碱和多糖，在治疗人体恶性肿瘤方面药用价值极高，主要用于治疗食道癌、胃癌等消化系统的肿瘤，其水煎汤剂在治疗小儿积食，消积化瘀方面也具有显著效果。

上个世纪中后期发展起来的现代发酵技术已成功应用于多种药用真菌的大规模制备，其中以液体发酵技术最为成熟。本次将液体发酵技术应用到木蹄层孔菌菌丝体的制备在国内尚属首例，研究结果表明该方案是可行的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种木蹄层孔菌及液体深层发酵制备木蹄层孔菌菌体的方法。

木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.1658，属于担子菌纲(Basidiomycetes)，多孔菌目(Polyporales)，多孔菌科(Polyporaceae)，层孔菌属(Fomes)。

液体深层发酵制备木蹄层孔菌菌体的方法：从野生木蹄子实体上分离纯化得到的木蹄层孔菌菌株，以该菌株为出发菌种，依次经固体斜面培养、摇床种子培养、发酵罐培养，制备木蹄层孔菌菌丝体。

所述的菌株的内转录间隔区核糖体DNA序列如下：

CCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGGTCAGAGTTCATAAAA

GCTGTCTCTGACGAGACCATTAGAAGCTCTCCAAACGCTTCACGGTCGCGGCGTAGACATTATCACAC

CGACAGCCGATCCGCAAGGAACCAAGCTAATGCATTTGAGAGGAGCTGACTCAAACGAGGGCCAGCAA

AAGCCTCCAATAAGCCAACCCTACAAACCCGCAAAGGTTTATAGGTTGAGAATTTCATGACACTCAAA

CAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCT

GCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCT

GAAAGTTGTATTATAGATGCGTTACATCAATAAACATTCTGTTACTTCAATAGTTTGTAAAGAAAACG

TGGGGCCAAGTGACGCCGCCGCAAAGCGACGCACCTGAAATCCCACAGTAAGTGCACAGGTGTAGAGT

GGATGAGCAGGGCGTGCACATGCCTCGGAAGGCCAGCTACAACCCATGTCAAAACTCGTTAATGATCC

TTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCA。

固体斜面培养的条件为：从保藏菌种接种到配制的斜面培养基上，温度20～30℃，培养160～240小时。

斜面培养基以每1000毫升计主要成份为：马铃薯100～300克、葡萄糖10～30克和琼脂15～25克，pH自然。

摇床种子培养的条件为：菌种固体斜面培养160～240后，菌丝体接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，在20～30℃培养，转速150～200rpm，培养62～96小时。

种子培养基以每1000毫升计主要成份为：葡萄糖10～60克、蛋白胨5～30克、酵母粉或酵母膏3～20克、麦芽浸出粉3～20克，pH自然。

发酵罐培养的方法是，液体种子摇床培养62～96小时后接种至装有发酵培养基的发酵罐中，接种量5～15％(V/V)、保持罐温20～30℃、罐压0.4～0.8kg/cm，搅拌速率100～200rpm，通气量1∶0.3～1∶1.2，发酵时间120～200小时。

发酵培养基从每1000毫升计主要成份为：葡萄糖20～80克、蛋白胨10～40克、酵母粉或酵母膏5～20克、MgSO₄0.2～1克和KH₂PO₄ 0.2～1克，培养基的pH值为4.0～7.0。

发酵罐培养采用液体深层通气发酵培养。

本发明的放罐标准是发酵液变得粘稠，镜检发现菌丝体开始老化。

经与其他培养工艺进行比较、反复试验验证，本发明效果显著：

(1)本发明中种子培养基提供了菌丝体短期内快速生长所需的营养物质，培养62小时左右即可进行深层发酵。

(2)本发明中液体深层通气发酵培养基，营养成分配比合理，能够保证木蹄层孔菌的生长需要，培养基材料丰富，整个分批发酵过程中只需一次配料、一次灭菌即可，具有省时、省工，又减少了由于中途加料造成染菌的机会。

(3)采用本发明中的液体深层通气发酵工艺进行分批发酵，每升发酵液可得到10～15克的干菌丝体。

(4)本发明是国内首次对木蹄层孔菌的发酵工艺进行研究，对于该菌以后的实验研究和工业化制备均有很大的指导意义。

具体实施方式

上述木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)系从我国吉林长白山山区采集的野生木蹄子实体中分离得到。现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.1658，属于担子菌纲(Basidiomycetes)，多孔菌目(Polyporales)，多孔菌科(Polyporaceae)，层孔菌属(Fomes)。

下面结合具体实施例来进一步详细描述本发明。

实施例1：菌株的分离培养

在实验室中按照下列条件分离培养，即可获得本发明所述的木蹄层孔菌。从我国吉林长白山山区采集的木蹄子实体，0.1％氯化汞消毒表面3min，无菌水漂洗后置于无菌滤纸上吸干水份，用无菌刀片切除部分外皮层，挑取一小块组织，移接到2％含100μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml链霉素的水琼脂平板上。在20℃～30℃温度下培养，待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA培养基上，连续重复纯化3～5次，获得纯培养。

实施例2：斜面培养基的制备

(1)取新鲜去皮马铃薯100克，切成0.5立方厘米左右的立方块，立即用水冲洗，用1000毫升蒸馏水煮沸20min，纱布过滤，取滤液加15克琼脂和10克葡萄糖加热溶解，加水定容至1000毫升，灭菌后即为斜面培养基。

(2)取新鲜去皮马铃薯200克，切成0.5立方厘米左右的立方块，立即用水冲洗，用1000毫升蒸馏水煮沸20min，纱布过滤，取滤液加20克琼脂和20克葡萄糖加热溶解，加水定容至1000毫升，灭菌后即为斜面培养基。

(3)取新鲜去皮马铃薯300克，切成0.5立方厘米左右的立方块，立即用水冲洗，用1000毫升蒸馏水煮沸20min，纱布过滤，取滤液加25克琼脂和30克葡萄糖加热溶解，加水定容至1000毫升，灭菌后即为斜面培养基。

实施例3：种子培养基的制备

(1)取葡萄糖10克、蛋白胨5克、酵母粉(膏)3克、麦芽浸出粉3克，将各组分混合溶解，加水定容至1000毫升，灭菌后即为种子培养基。

(2)取葡萄糖30克、蛋白胨20克、酵母粉(膏)10克、麦芽浸出粉10克，将各组分混合溶解，加水定容至1000毫升，灭菌后即为种子培养基。

(3)取葡萄糖60克、蛋白胨30克、酵母粉(膏)20克、麦芽浸出粉20克，将各组分混合溶解，加水定容至1000毫升，灭菌后即为种子培养基。

实施例4：液体深层发酵培养基的制备

(1)取葡萄糖20克、蛋白胨10克、酵母粉(膏)5克、MgSO₄ 0.2克、KH₂PO₄0.2克。将上述成分混合加水至1000毫升，另外加0.6毫升泡敌作消泡剂，调pH到4.0，灭菌后即为发酵培养基。

(2取葡萄糖40克、蛋白胨20克、酵母粉(膏)10克、MgSO₄ 0.5克、KH₂PO₄0.5克。将上述成分混合加水至1000毫升，另外加0.6毫升泡敌作消泡剂，调pH到5.0，灭菌后即为发酵培养基。

(3)取葡萄糖80克、蛋白胨40克、酵母粉(膏)20克、MgSO₄ 1克、KH₂PO₄1克。将上述成分混合加水至1000毫升，另外加0.6毫升泡敌作消泡剂，调pH到7.0，灭菌后即为发酵培养基。

实施例5：液体深层培养方法一

(1)取按实施例2配制的新鲜斜面培养基，挑取保藏菌种的菌丝体采用涂布或划线的方法接种到斜面培养基上，于20℃培养240小时。

(2)选菌丝体繁茂的斜面培养菌种，从上挑取菌丝体或挖取菌苔接种于装有按实施例3制备的液体种子培养基的摇瓶中，在温度20℃、转速150rpm条件下，培养96小时。

(3)取处于对数生长中后期的种子培养物，以15％(V/V)的接种量转接入装有按实施例4制备的发酵培养基的发酵罐中，保持罐温20℃、罐压0.5kg/cm，搅拌速率100rpm，通气量1∶0.3，发酵培养时间200小时。待发酵液变粘稠，镜检观察菌丝体开始老化时，停止发酵、放罐，分别收集菌丝体和发酵液，每升发酵液可获得10g以上的干燥菌丝体。

实施例6：液体深层培养方法二

(1)取按实施例2配制的新鲜斜面培养基，挑取保藏菌种的菌丝体采用涂布或划线的方法接种到斜面培养基上，于25℃培养200小时。

(2)选菌丝体繁茂的斜面培养菌种，从上挑取菌丝体或挖取菌苔接种于装有按实施例3制备的液体种子培养基的摇瓶中，在温度25℃，转速180rpm条件下培养62小时。

(3)取处于对数生长中后期的种子培养物，以5％(V/V)的接种量转接入装有按实施例4制备的发酵培养基的发酵罐中，保持罐温25℃、罐压0.6kg/cm，搅拌速率150rpm，通气量1∶0.6，发酵培养时间120小时。待发酵液变粘稠，镜检观察菌丝体开始老化时，停止发酵、放罐，分别收集菌丝体和发酵液，每升发酵液可获得10g以上的干燥菌丝体。

实施例7：液体深层培养方法三

(1)取按实施例2配制的新鲜斜面培养基，挑取保藏菌种的菌丝体采用涂布或划线的方法接种到斜面培养基上，于30℃培养160小时。

(2)选菌丝体繁茂的斜面培养菌种，从上挑取菌丝体或挖取菌苔接种于装有按实施例3制备的液体种子培养基的摇瓶中，在温度30℃，转速200rpm条件下培养80小时。

(3)取处于对数生长中后期的种子培养物，以10％(V/V)的接种量转接入装有按实施例4制备的发酵培养基的发酵罐中，保持罐温30℃，罐压0.8kg/cm，搅拌速率200rpm，通气量1∶1.2，发酵培养180小时左右。待发酵液变粘稠，镜检观察菌丝体开始老化时，停止发酵、放罐，分别收集菌丝体和发酵液，每升发酵液可获得10g以上的干燥菌丝体。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。

本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。