利用黄瓜幼苗内生真菌种子处理防治南方根结线虫的研究

摘要

黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界范围内广泛种植的蔬菜，其生产常常受到根结线虫(Meloidogyne spp.)的危害。为了提高产量，化学杀线剂被应用到生产中，但化学杀线剂往往使用成本高、毒性强，并且破坏土壤环境，因此有必要积极寻求其替代防治措施。内生真菌是一类对植物有保护作用的有益真菌，近年来开发利用内生真菌防治植物线虫称为了研究热点之一。根结线虫是土传病原，为了让内生真菌从作物生长的早期阶段即开始保护其免受根结线虫的危害，并尽量减少使用剂量，种子处理被认为是一种适宜的施用方法。但迄今为止相关研究还较少。本论文对利用黄瓜内生真菌种子处理防治南方根结线虫的可行性进行了研究，主要结果如下：
　　 1.分离了来自热带、亚热带和温带的514个黄瓜幼苗内生真菌菌株，这些菌株分布在枝顶霉属(Acremonium spp.)、放射毛霉属(Actinomucor spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、短梗霉属(Aureobasidium spp.)、黑霉属(Cercospora spp.)、毛壳菌属(Chaetomium spp.)、瓜枝孢属(Cladosporium spp.)、炭疽菌属(Colletotrichum spp.)、弯孢菌属(Curvularia spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、黑腐质霉属(Humicola spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、叶点霉属(Phyllosticta spp.)、壳多孢属(Stagonospora spp.)、毛霉属(Trichoderma spp.)等16个属及其他未知的属中，其中镰刀菌属菌株分离频率最高。筛选了其中在PDA培养基上生长及产孢良好的294个菌株在温室中对南方根结线虫的控制效果，其中23个菌株显著降低了根结形成数，占总筛选菌株数的7.9％。对南方根结线虫抑制效果最好的10个菌株分别为镰刀菌Fu7、Fu9、Fu546、Fu234、Fu654、叶点霉Ph511、毛壳菌Ch1001、毛霉菌Tr882、拟青霉菌号Pa972、枝顶孢Ac985。他们作为种子处理对南方根结线虫的控制效果在24.0％到58.4％之间。重复测定了10菌株的防治效果，重复测定防治效果在15.6％和44.3％之间，在两次测验中，Fu234、Ch1001和Pa972表现出了最高的控制效果。测定首次发现了叶点霉属真菌菌株对植物线虫一定程度的控制作用。
　　 2.10个菌株对黄瓜幼苗的生长均没有负面影响，说明他们不是幼苗致病菌株。其中Ac985和Fu546对幼苗的生长有显著促进作用。定植实验表明，5个镰刀菌倾向于定植根部，它们在根部的定植率在20.1％到44.0％之间，毛霉Tr882、拟青霉Pa972及枝顶霉Ac985在地上部和地下部的定植均较低。叶点霉Ph511和毛壳菌在根部和地上部均能较好定植，Ch1001定植能力最强，其在根部和地上部的定植率分别为70.5％和73.5％。
　　 3.Ch1001、Pa972、Ac985菌株的培养滤液对南方根结线虫二龄幼虫(J2)有致死作用，Ph511菌株的培养滤液对J2有麻痹效果。Tr882、Pa972、Ac985、Ph511及Ch1001菌株的培养滤液对J2有趋避作用。Fu234、Ch1001、Fu654、Fu9和Ac985培养滤液显著降低了卵孵化率和生活力。J2与Fu234、Fu654、Pa972、Ph511及Ch1001的菌丝后活动性降低，而Pa972、Ch1001、Fu234、Fu654及Fu9的菌丝能寄生根结线虫的卵。
　　 4.用黄瓜裂根系统(split root system)研究了10菌株诱导黄瓜幼苗产生根结线虫抗性的能力。镰刀菌Fu234、Fu654、毛壳菌Ch1001以及叶点霉Ph511在挑战根系中接种后应答根系中的线虫入侵分别减少了42.4％、35.7％、38.4％及23.6％；10菌株挑战接种对应答根系中根结线虫的发育均没有影响；Ch1001、Fu234、Pa972挑战接种后，应答根系中的雌虫的平均产卵数显著性降低。
　　 5.根据菌株对根结线虫在温室盆钵中的控制效果、对黄瓜生长影响、定植能力、对二龄幼虫和卵的离体作用及诱导抗性测定结果等，分离白海南的毛壳菌Ch1001被认为是很有潜力用于黄瓜种子处理防治南方根结线虫的菌株。结合菌株的形态学和rDNA-ITS片段特征，鉴定菌株Ch1001为球毛壳菌(C.globosum Kunze)。
　　 6.从Ch1001培养滤液中用乙酸乙酯提取到了一种褐色的疑似为毛壳菌素的纯物质，但生物测定结果表明该物质不是毒杀J2的化合物。毒杀J2的化合物可能是一种具挥发性的有机酸。从Ch1001培养滤液中检测到了几丁质酶活性，胶体几丁质能提高ch1001几丁质酶产量，培养滤液的几丁质酶活性与卵孵化抑制率呈正相关性。
　　 7.1×107孢子以下剂量处理黄瓜种子不会降低幼苗根系活力，是ch1001种子处理的安全剂量。Ch1001对幼苗苯丙氨酸解氨酶和几丁质酶的活性没有影响。1×105到1×107之间的孢子剂量处理种子，幼苗的过氧化物酶和过氧化氢酶活性显著增强。Ch1001孢子剂量从1×104到1×108均显著性降低了根结线虫的入侵。1×106到1×107孢子是达到根结线虫最高防效的Ch1001种子处理剂量。
　　 8.黄瓜根系分泌物对J2的活动有趋向性，根边缘细胞对J2的活动没有趋向性，Ch1001处理后根系分泌物和根边缘细胞对J2的活动没有影响；黄瓜根系分泌物促进卵孵化，根边缘细胞不能促进卵孵化，Ch1001处理后在根系分泌物和根边缘细胞中卵的孵化也没有影响；在Ch1001处理后的黄瓜根边缘细胞悬浮液中，J2的口针分泌物明显比在无Ch1001处理的对照根边缘细胞悬浮液中少，Ch1001可能干扰了J2对来自黄瓜根边缘细胞信号的反应。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

致谢

第一章 文献综述与研究背景

1 黄瓜上根结线虫种类、生物学特性、危害及防治

1.1 黄瓜上发生的根结线虫种类

1.2 根结线虫的生物学特性

1.3 根结线虫对黄瓜的危害

1.4 根结线虫的防治

2 内生真菌的概念、多样性及在植物保护中的作用

2.1 内生真菌的概念

2.2 内生真菌的多样性

2.3 内生真菌在植物保护中的应用

3 内生真菌防治线虫病害的研究进展

3.1 内生真菌成功防治植物线虫的例子

3.2 内生真菌防治植物线虫的作用机制

3.3 内生真菌用于植物线虫病害防治的优势

4 内生真菌用于种子处理防治根结线虫的潜力

4.1 种子处理防治线虫病害

4.2 内生真菌种子处理

5 本研究的目的和内容

5.1 研究目的

5.2 研究内容

第二章 论文中常使用的材料和方法

1 常用材料

1.1 供试黄瓜品种

1.2 抗生素母液

1.3 常用培养基

1.4 表面消毒液

1.5 植物肥料

1.6 植物根部线虫染色液

2 常用实验方法

2.1 供试线虫准备

2.2 土壤基质准备

2.3 真菌菌株培养及孢子悬浮液配制

2.3 真菌孢子的计数

2.5 真菌菌株的保存

2.6 植物根中线虫染色并计数

2.7 统计分析及图表

第三章 黄瓜幼苗内生真菌的分离及其作为种子处理对南方根结线虫控制作用的筛选

1 材料与方法

1.1 内生真菌分离

1.2 菌株的纯化、保存及初步鉴定

1.3 内生菌株防治根结线虫的筛选

1.4 初筛选菌株对根结线虫防治效果的重复测定

1.5 初筛选菌株对黄瓜幼苗生长的影响

1.6 初筛选菌株在黄瓜幼苗上的定植

2 结果

2.1 黄瓜幼苗内生真菌的多样性

2.2 黄瓜幼苗内生真菌作为种子防治南方根结线虫的筛选

2.3 初筛选菌株的对南方根结线虫防治的重复测定

2.4 初筛选菌株对黄瓜幼苗生长的影响

2.5 初筛选菌株在黄瓜幼苗上的定植能力

3 讨论

第四章 10株黄瓜幼苗内生真菌对南方根结线虫的离体作用

1 材料与方法

1.1 供试菌株

1.20.67％曙红Y溶液

1.3 菌株培养滤液的准备

1.4 菌株培养滤液对J2的致死作用测定

1.5 菌株培养滤液对J2活动的趋避作用测定

1.6 菌株培养滤液对卵孵化及卵活力的影响

1.710株内生菌菌丝对J2体壁穿透及虫体消化的观察

1.8 菌丝对卵寄生的观察

2 结果

2.110菌株培养滤液对J2的致死或麻痹作用

2.210菌株培养滤液对二龄幼虫活动的趋避性

2.310菌株培养滤液对卵孵化和卵活力的影响

2.410株内生菌菌丝对J2的作用

2.5 菌丝对卵寄生的观察

3 讨论

第五章 10株黄瓜幼苗内生真菌诱导植株产生根结线虫抗性的研究

1 材料与方法

1.1 供试菌株

1.2 黄瓜幼苗根系分成“挑战”根系和“应答”根系

1.3 供试菌株接种

1.4 线虫接种

1.5 计数应答根系中线虫的入侵总数

1.6 应答根系中线虫的发育和繁殖

2 结果

2.1“应答”根系中线虫的入侵

2.2“应答”根系中的线虫发育和繁殖

3 讨论

第六章 黄瓜幼苗内生毛壳菌CH1001菌株鉴定

1 材料与方法

1.1 形态学鉴定

1.2 rDNA-ITS鉴定

2 结果

2.1 Ch1001形态特征

2.2 Ch1001菌株rDNA-TIS

3 讨论

第七章 黄瓜内生球毛壳菌CH1001菌株产生的杀线虫活性物质分析

1 材料与方法

1.1 毛壳菌素提取与生物活性测定

1.2 Ch1001产生几丁质酶检测及对卵孵化的抑制

1.3 杀线虫活性物质的挥发性的测定

1.4 培养滤液pH值杀线虫活性的相关性研究

2 结果

2.1 毛壳菌素的产生和其对根结线虫的作用

2.2 Ch1001菌株的几丁质酶活性及对卵孵化的抑制

2.3 Ch1001致死二龄幼虫物质的挥发性

2.4 培养滤液pH值杀线虫活性与的相关性

3 讨论

第八章 黄瓜内生球毛壳菌CH1001菌株种子处理剂量与幼苗根系活力、防御酶活性及根结线虫控制效果的关系

1 材料和方法

1.1 梯度浓度Ch1001孢子悬浮液的制备及种子处理

1.2 根系活力测定

1.3 防御酶活性测定

1.4 Ch1001接种剂量与根结线虫防治效果的关系

2 结果

2.1 Ch1001接种剂量与根系活力的关系

2.2 Ch1001接种剂量与防御酶活性的关系

2.3 Ch1001菌株种子处理剂量与根结线虫控制效果关系

3 讨论

第九章 黄瓜内生球毛壳菌CH1001菌株对根系分泌物及根尖边缘细胞与根结线虫活动关系的影响

1 材料与方法

1.1 根系分泌物收集

1.2 根边缘细胞收集

1.3 根系分泌物及根边缘细胞对卵孵化的影响

1.4 根系分泌物和根边缘细胞对二龄幼虫的吸引指数测定

1.6 Ch1001对根系分泌物和根边缘细胞刺激J2口针分泌的影响

2 结果

2.1 Ch1001对根系分泌物和根边缘细胞中根结线虫卵孵化的影响

2.2 Ch1001对根系分泌物和根边缘细胞对J2吸引力的影响

2.3 Ch1001对根系分泌物和根边缘细胞刺激二龄幼虫口针分泌的影响

3 讨论

全文小结

1 本研究主要结果

2 本研究的主要创新点

3 主要不足与有待进一步认识的问题

参考文献

附录A：球毛壳CH1001菌株RDNA-ITS序列

附录B：本论文使用仪器