海洋黑曲霉生产耐盐型纤维素酶和β-葡糖苷酶及其酶学性质研究

摘要

纤维素酶是将纤维素降解为葡萄糖的酶，由内切酶、外切酶和β-葡糖苷酶组成。β-葡糖苷酶将纤维二糖降解为葡萄糖，是酶解纤维素过程中的关键步骤之一。耐盐纤维素酶可以在高盐环境下高效降解纤维素，造纸和纤维素预处理废水的治理，海洋垃圾、海藻和海草中纤维素的高效利用，盐碱地的修复等需要耐盐的纤维素酶。
　　 本论文从海洋中筛选产耐盐纤维素酶的菌株，通过对具有良好耐盐性能的纤维素酶和β-葡糖苷酶的发酵工艺、酶学性质、普遍的耐盐机制等的研究，为高盐环境中纤维素的降解打下基础。论文研究包括以下内容:
　　 首先，从海洋中筛选得到产耐盐纤维素酶的真菌，根据该真菌的形态，ITS序列和5％ NaCl(w/v)最适生长盐度，鉴定该真菌为嗜盐海洋黑曲霉。海洋黑曲霉产生的纤维素酶最适温度和pH为58℃和4.5，在12％ NaCl(w/v)溶液中的酶活最大，是在无NaCl溶液中酶活的1.33倍。该纤维素酶在黑液废水中降解纤维素，降解12h产生的葡萄糖比在自来水中降解纤维素产生的葡萄糖多了11.5％。研究结果表明，海洋黑曲霉产生的纤维素酶是一种具有良好耐盐耐热性能的纤维素酶。
　　 其次，研究了纤维素酶的固体发酵工艺，实现了纤维素酶的环境友好型生产。固体发酵的天然培养基最优组成为:76.9％水葫芦(w/w)，8.9％玉米芯(w/w)，3.5％稻草粉(w/w)，10.7％麸皮(w/w)和干固体基质2.33倍的天然海水。天然海水中的主要无机盐都能增加纤维素酶的产量。发酵144 h，纤维素酶的酶活达到17.80 U/g干固体基质。
　　 第三，研究了液体发酵时海洋黑曲霉纤维素酶酶活和胞外蛋白表达对不同碳源的响应。海洋黑曲霉纤维素酶的酶活和胞外蛋白对不同碳源的响应有较大差异。在以玉米芯或稻草秆作为碳源时，液体发酵产生的内切酶、β-葡糖苷酶和纤维素酶的酶活分别为2.00 U/mL和1.70 U/mL、3.25 U/mL和2.62 U/mL、0.13和0.08 U/mL，比活力分别为1.39 U/mg蛋白和1.31 U/mg蛋白，3.25 U/mg蛋白和2.62 U/mg蛋白，0.181 U/mg蛋白和0.165 U/mg蛋白。二维电泳分析表明，以玉米芯或稻草秆作为碳源时，海洋黑曲霉产生的胞外蛋白的种类差异达到15种。
　　 第四，用丝瓜囊作为固定化载体固定海洋黑曲霉，连续批次发酵生产β-葡糖苷酶。丝瓜囊固定的菌丝量达到3.1 g/L，固定效率达到95％以上。固定化发酵缩短了发酵周期，达到最大产量的时间由游离发酵的7d降为固定化发酵的4.5 d。固定化发酵的第3、4批次的产量高于游离发酵的产量，固定化连续5批次发酵的β-葡糖苷酶产量均高于110 U/mL。
　　 第五，研究了β-葡糖苷酶在不同盐度下的酶学性质和热失活动力学。粗β-葡糖苷酶在6％ NaCl(w/v)溶液中的酶活最高。在0％和6％ NaCl(w/v)溶液中的最适温度和pH相同，都为66℃和5.0。在6％ NaCl(w/v)溶液中的酶活是在无NaCl溶液中的1.46倍。在62℃，65℃，67℃和70℃，β-葡糖苷酶在6％NaCl(w/v)溶液中的半衰期均高于在无NaCl溶液中半衰期的2倍以上。β-葡糖苷酶在6％ NaCl(w/v)溶液中的热失活自由能比在无NaCl溶液中的热失活自由能和熔点温度分别高了约2 kJ/mol，熔点温度也略微提高。纯化后测得β-葡糖苷酶的分子量约为110 kDa。在高盐度环境下，纯β-葡糖苷酶的酶活和半衰期的增长与粗β-葡糖苷酶酶活和半衰期的增长相似。研究结果表明该海洋黑曲霉产生的β-葡糖苷酶是耐盐耐热型β-葡糖苷酶。
　　 第六，构建了β-葡糖苷酶的分子模型，探讨了该类酶的耐盐机制。建立了该类酶的分子模型，大量的谷氨酸和天冬氨酸残基分布在分子模型表面。在分子表面的大量酸性氨基酸残基赋予β-葡糖苷酶高负离子型表面，高负离子型表面和分子内核的作用可能增强了β-葡糖苷酶在高盐环境下的热稳定性。β-葡糖苷酶在高盐度下活性增加的原因可能是高盐的环境使β-葡糖苷酶异构化，异构体的催化位点更容易与底物纤维素二糖作用。
　　 本论文对耐盐纤维素酶和β-葡糖苷酶的高效生产，高盐环境下纤维素酶和β-葡糖苷酶性质、β-葡糖苷酶耐盐机理等的研究，对高盐环境下的纤维素的高效降解具有重要的意义。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 纤维素酶的催化机制

1．2．耐盐纤维素酶的应用

1．2．1 处理造纸工业废水

1．2．2 开发利用海洋垃圾中的纤维素资源

1．2．3 处理纤维素原料预处理产生的废水

1．2．4 降解海藻和海草组织中的纤维素

1．2．5 修复盐碱地

1．3 海洋微生物生产的纤维素酶

1．4 海洋微生物的分离和鉴定

1．4．1 海洋微生物的分离

1．4．2 微生物分子生物学鉴定

1．5 纤维素酶的发酵工艺

1．6 纤维素酶的分离纯化

1．7 纤维素酶的基因获取和分子模拟

1．7．1 纤维素酶基因的获取

1．7．2 纤维素酶的分子模拟

1．8 本论文研究的主要内容与思路

第二章 产耐盐纤维素酶的海洋微生物的筛选和鉴定

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 仪器和试剂

2．2．2 样品和海水采集

2．2．3 海洋微生物的分离

2．2．4 海洋微生物的保藏

2．2．5 微生物的活化、扩培和发酵产酶

2．2．6 酶液制备和酶活测定

2．2．7 纤维素酶耐盐性能的测定

2．2．8 产纤维素酶的海洋微生物的鉴定

2．2．9 盐度对海洋黑曲霉生长的影响

2．2．10 海洋黑曲霉产生的纤维素酶的酶学性质

2．2．11 海洋黑曲霉产生的纤维素酶降解高盐环境中纤维素的能力

2．3．结果和讨论

2．3．1 分离得到的海洋微生物

2．3．2 筛选得到的产纤维素酶的海洋微生物

2．3．3 耐盐纤维素酶高产海洋真菌的鉴定

2．3．4 盐度对海洋黑曲霉生长的影响

2．3．5 温度对海洋黑曲霉产生的纤维素酶酶活的影响

2．3．6 pH对海洋黑曲霉产生的纤维素酶酶活的影响

2．3．7 盐度对海洋黑曲霉产生的纤维素酶酶活的影响

2．3．8 海洋黑曲零产生的纤维素酶在高盐度下对纤维素的降解

2．4 本章小结

第三章 海洋黑曲霉固体发酵生产纤维素酶

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 仪器和试剂

3．2．2 菌种和培养基

3．2．3 固体发酵生产纤维素酶

3．2．4 纤维素酶酶活检测

3．2．5 产酶培养基的优化

3．2．6 不同种类的水对纤维素酶产量的影响

3．2．7 无机盐对纤维素酶产量影响

3．2．8 葡萄糖胺含量的测定

3．3 结果和讨论

3．3．1 产酶培养基的优化

3．3．2 不同种类水的添加对纤维素酶产量的影响

3．3．3 无机盐对纤维素酶产量的影响

3．3．4 发酵进程分析

3．4 本章小结

第四章 海洋黑曲霉的纤维素酶酶活和胞外蛋白表达对不同碳源的响应

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 仪器和试剂

4．2．2 发酵产酶

4．2．3 菌体量的测定

4．2．4 蛋白质的提取和测量

4．2．5 酶活测定

4．2．6 二维电泳

4．2．7 凝胶染色和图像分析

4．3 结果和讨论

4．3．1 海洋黑曲霉的生长和纤维素酶的产率对不同碳源的响应

4．3．2 内切酶对不同碳源的响应

4．3．3 β-葡糖苷酶对不同碳源的响应

4．3．4 滤纸酶活对不同碳源的响应

4．3．5 胞外蛋白表达对不同碳源的响应

4．4 本章小结

第五章 海洋黑曲霉固定化发酵生产β-葡糖苷酶

5．1 前言

5．2 材料和方法

5．2．1 仪器和试剂

5．2．2 菌体固定化

5．2．3 固定化发酵生产β-葡糖苷酶

5．2．4 β-葡糖苷酶的酶活检测

5．2．5 菌丝固定效率的测量

5．2．6 固定菌丝的形态观察

5．3 结果和讨论

5．3．1 丝瓜囊的丝和网格结构

5．3．2 菌体在丝瓜囊上的固定

5．3．3 菌丝在多批次发酵过程中的形态

5．3．4 丝瓜囊固定菌丝的量和固定效率

5．3．5 重复批次发酵过程中菌丝的固定量

5．3．6 游离发酵和固定化发酵的p-葡糖苷酶产量

5．4 本章小结

第六章 海洋黑曲霉产生的β-葡糖苷酶的性质和耐盐机理

6．1 前言

6．2 材料和方法

6．2．1 仪器和试剂

6．2．2 β-葡糖苷酶的生产，粗酶液制备和酶活检测

6．2．3 盐度、温度和pH对β-葡糖苷酶酶活的影响

6．2．4 β-葡糖苷酶的半衰期测定

6．2．5 海洋黑曲霉产生的β-葡糖苷酶的热失活动力学分析

6．2．6 海洋黑曲霉产生的β-葡糖苷酶的熔点测定

6．2．7 海洋黑曲霉产生的β-葡糖苷酶的分离纯化

6．2．8 黑曲霉产生的β-葡糖苷酶的编码序列测序

6．2．9 黑曲霉产生的β-葡糖苷酶的序列比对和分子建模

6．3 结果和讨论

6．3．1 盐度对粗β-葡糖苷酶酶活的影响

6．3．2 温度对粗β-葡糖苷酶酶活的影响

6．3．3 pH对粗β-葡糖苷酶酶活的影响

6．3．4 盐度对粗β-葡糖苷酶半衰期的影响

6．3．5 粗β-葡糖苷酶在不同盐度下焓变、熵变和自由能

6．3．6 不同盐度下β-葡糖苷酶的熔点

6．3．7 纯β-葡糖苷酶在不同盐度下的半衰期和酶活

6．3．8 β-葡糖苷酶编码序列PCR扩增和测序

6．3．9 黑曲霉种属β-葡糖苷酶分子建模和耐盐机制分析

6．4 本章小结

第七章 总结与展望

7．1 结论

7．2 论文创新点

7．3 展望和建议

参考文献

读博士期间主要研究成果

作者简介