紫杉木霉木霉菌素生物合成相关基因及Tri3基因对木霉素合成的影响

摘要

紫杉木霉（Trichoderma taxi）是从南方红豆杉分离的一种内生真菌，它可以产生具有抑菌活性的物质木霉菌素(trichodermin)。木霉菌素能有效地抑制立枯丝核菌、灰葡萄孢等病原真菌的生长，并具有开发为生物农药的应用前景。在木霉菌素的发酵过程中，木霉菌素产量于发酵前期随时间增加而不断上升，但在发酵后期产量反而下降。本研究目的是解析紫杉木霉中木霉菌素的生物合成途径及生物合成相关基因，通过基因改造获得紫杉木霉工程菌株，突破木霉菌素发酵瓶颈，达到木霉菌素的高产。
　　根据紫杉木霉基因组测序结果，紫杉木霉中木霉菌素生物合成相关的七个基因Tri3、Tri4、Tri6、Tri10、Tri11、Tri12、Tri14形成一个基因簇。紫杉木霉与苇状木霉（T.arundinaceum）、短密木霉（T.brevicompactum）、拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）和禾谷镰刀菌（Fgraminearum）的Tri基因同源性很高，其编码起始位点、编码序列的大小都非常相似。
　　苇状木霉的Tri3基因可能编码了木霉菌醇(trichodermol)C-4位乙酰化反应生成哈茨木霉素（harzianumA）所需的酶。由于紫杉木霉Tri3基因与苇状木霉的Tri3基因同源性很高，推测紫杉木霉的Tri3基因可能编码木霉菌醇C-4位乙酰化反应生成木霉菌素的酶。利用农杆菌介导的ATMT方法敲除紫杉木霉Tri3基因得到敲除突变体，与野生型相比，突变体发酵液中木霉菌素浓度大幅减小、木霉菌醇浓度没有明显变化;突变体发酵液活性降低，对病原真菌的抑制性降低。因此，推测Tri3基因与木霉菌醇生成木霉菌素过程有关，在一定程度上能较大地影响木霉菌素的产量，但Tri3基因可能不是控制木霉菌醇生成木霉菌素过程的唯一基因。或者Tri3编码的酶调控木霉菌醇生成木霉菌素过程的发生，只是在发酵中，这一过程被阻断，触发了旁路反应，导致微量的木霉菌素产生。
　　木霉菌素生物合成相关的Tri基因的研究至关重要，它可使我们明确木霉菌素生物合成过程中的各反应机制及相关基因的表达机制，了解有关Tri基因簇的进化过程，从而为生物农药的开发做出贡献。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物内生真菌与紫杉木霉

1．1．1 植物内生真菌

1．1．2 紫杉木霉

1．2 木霉菌素及单端孢霉烯类化合物

1．3 Tri基因

1．3．1 镰刀菌的Tri基因

1．3．2 木霉的Tri基因

1．3．3 露湿漆斑菌的Tri基因

1．3．4 Tri5、Tri4、Tri6、Tri3基因的功能

1．4 研究目的及意义

第二章 材料与方法

2．1 基因组测序结果分析

2．1．1 紫杉木霉全基因组序列测定及拼接

2．1．2 紫杉木霉的Tri基因查找

2．1．3 紫杉木霉的Tri基因的同源对比

2．1．4 紫杉木霉的Tri基因的分布情况作图

2．2 试验菌株及保存、培养条件

2．2．1 真菌菌株及保存、培养条件

2．2．2 细菌菌株及培养条件

2．2．3 培养基的配制

2．3 载体的构建

2．3．1 聚合酶链反应PCR

2．3．2 DNA操作

2．3．3 质粒大肠杆菌转化

2．3．4 载体T-Tri的构建

2．3．5 敲除载体1300-ΔTri3的构建

2．3．6 互补载体1300-Tri3的构建

2．3．7 表达载体PYES2-g9的构建

2．4 紫杉木霉基因组DNA的提取

2．5 紫杉木霉RNA的提取及cDNA的制备

2．6 紫杉木霉T-DNA转化

2．6．1 紫杉木霉对抗生素抗性临界浓度的筛选

2．6．2 农杆菌的冻融法转化

2．6．3 紫杉木霉ATMT

2．7 RealTime-PCR

2．8 发酵液的制备、提取、检测

2．9 发酵液活性检测

2．10 水稻共培养

2．10．1 水稻种子消毒

2．10．2 紫杉木霉与水稻的共培养

2．11 酵母中的真核表达

2．11．1 质粒转入酵母细胞

2．11．2 酵母细胞壁的破除与粗酶液的制取

第三章 紫杉木霉Tri基因簇分析

3．1 紫杉木霉基因组测序结果分析

3．2 紫杉木霉Tri基因的查找

3．3 紫杉木霉contig57的开放阅读框分析

3．4 紫杉木霉中Tri基因保守区分析与木霉菌素合成过程

3．5 紫杉木霉Tri基因分布

3．6 Tri基因编码序列的克隆与分析

第四章 紫杉木霉Tri3基因功能分析

4．1 紫杉木霉TtΔTri3突变菌株的获得

4．1．1 紫杉木霉对潮霉素抗性相关临界浓度的筛选

4．1．2 紫杉木霉ATMT转化

4．1．3 TtΔTri3菌株与野生型菌株发酵液HPLC检测

4．2 Tri3基因的回补与ΔTri3-tri3突变体的获得

4．2．1 紫杉木霉对G418抗性相关临界浓度的筛选

4．2．2 突变体菌株TtΔTri3-5#的ATMT转化

4．2．3 ΔTri3-tri3菌株与野生型菌株发酵液HPLC检测

4．3 突变体TtΔTri3菌落形态观察

4．4 Tri基因在突变体TtΔTri3中的表达情况

4．4．1 紫杉木霉Actin基因的查找

4．4．2 Tri基因表达情况

4．5 突变体TtΔTri3的发酵液活性检测

4．6 紫杉木霉野生型菌株和敲除突变体与水稻的共培养

4．8 Tri3基因在酵母中的诱导表达

第五章 讨论

5．1 小结

5．2 实验展望

参考文献

附表