Tn4560在圈卷产色链霉菌中的转座及其在尼可霉素生物合成相关基因克隆中的应用

摘要

采用常规转化方法用来自天蓝色链霉菌J1501的质粒pUC1169(pMT660::Tn4556::vph)多次转化尼可霉素产生菌圈卷产色链霉菌野生型7100的原生质体,均未得到转化子.采用限制性热衰减法于50°C,30min溶菌制备7100的原生质体,获得了转化子,但转化频率极低,只有0.4个转化子/μg DNA.用来自7100的pUC1169再转化不含pUC1169的7100原生质体,转化频率提高103～104倍.于39℃,MM/Vio条件下培养携带有pUC1169的7100孢子,Tn4560发生转座,筛选到4068个转座菌落,并从中得到8株尼可霉素阻断突变株;对这8株突变株的总DNA进行Southem杂交分析表明,Tn4560至少在4个不同的位点插入到7100的染色体上.用实验室已获得的与尼可霉素生物合成有关的30kb DNA片段为探针和经不同酶切的8株突变株的总DNA进行Southem杂交,结果表明,除阻断突变株Nik5有杂交信号且杂交信号大小均同野生型7100外,其余7株突变株均无任何杂交信号.HPLC分析表明,8株突变株在产生尼可霉素方面可分为两种类型,Nik5为1种类型,其余7株为另一种类型.初步推测这7株突变株基因组DNA与尼可霉素生物合成有关的部分发生了大片断的缺失.以Tn4560为探针,构建Nik5的部分基因文库,克隆到Tn4560侧翼4.2kb和0.6kb的染色体DNA片断,并对这两个DNA片段进行了序列分析,结果表明4.8kb的DNA片段含有两个完整的开放阅读框和一个不完整的开放阅读框,此DNA片段已送GenBank注册,登记号为AF349618.