不同链/支比玉米淀粉颗粒结构原位表征与分析

摘要

淀粉修饰型基因可以不同程度地改变淀粉颗粒中直链淀粉和支链淀粉的含量，生成不同链/支比淀粉。淀粉的直链/支链含量比、颗粒表面形貌、颗粒直径、结晶度等微观结构与其品质和加工性能密切相关，如淀粉糊的透明度、酶解力、凝胶强度、凝沉特性、流变学特性等。因此，研究不同链/支比玉米淀粉颗粒的结构、形态及化学组成等对其在食品和淀粉工业中的应用以及在玉米品种的育种筛选中具有重要意义。 本文以五种不同链/支比玉米品种（WT、ae、GEMS-0067、wx ae和ae du）为研究对象，分别利用光学显微镜、偏光显微镜、扫描电镜和原子力显微镜对其不同位置处的淀粉颗粒形态、KI/I2溶液染色结果、偏光十字、生长环、blocklet结构等进行原位观察和表征;采用近红外和拉曼光谱技术对不同链/支比玉米品种进行了分析与鉴别;最后用红外和拉曼化学成像技术对不同链/支比玉米品种不同位置处的淀粉进行了吸水能力、老化能力、结晶度、线性链与分支链比等定性分析，并用红外化学成像技术结合图像的主成分分析对不同玉米品种进行了鉴别分析。 主要研究内容和结论如下: (1) WT玉米胚乳淀粉KI/I2溶液染色后均呈深蓝色，颗粒为球状;ae玉米冠部胚乳部分淀粉颗粒呈煎鸡蛋状，中间为深蓝色，周围为粉红色，颗粒为球状或不规则球状，ae基因的引入使得淀粉颗粒形态不均匀性增加，且主要发生在淀粉积累的初期;GEMS-0067玉米淀粉颗粒染色后均呈深蓝色，颗粒呈细长棒状、球状、无规则球状、熔融状、多颗粒融合状等，说明HAM基因可以使淀粉颗粒增长，增加淀粉颗粒形态的不均匀性;wx ae玉米淀粉颗粒KI/I2溶液染色后均为粉红色，颗粒呈无规则球状，中部和基部胚乳细胞中心和靠近细胞壁的淀粉颗粒直径差异较大，wx和ae基因的引入同样导致淀粉颗粒不均匀性增加;ae du玉米冠部和中部内部胚乳淀粉染色后有的呈深蓝色，有的呈粉红色，分布无规律，颗粒大小均匀，说明du基因的引入可以使得原来ae玉米淀粉的不均匀性增加，单个颗粒不均匀性增加，向两极化发展。 (2) WT玉米淀粉颗粒在偏振光下有明亮清晰的偏光十字，颗粒内部结晶状态分布均匀，整个颗粒呈球晶结构;ae玉米淀粉颗粒的偏光结果复杂，典型煎鸡蛋状ae淀粉颗粒中心有偏光十字，周围为暗黑色，中心与周围结晶状态不一样，还有的淀粉颗粒的偏光十字是由两个或多个偏光十字连接而成，这些变化都是由ae基因引起的;GEMS-0067细长棒状淀粉颗粒的偏光十字由两个或者多个偏光十字连接而成，球状颗粒仍有单一且明亮的偏光十字，说明HAM和ae两个基因的引入并没有改变颗粒内部结晶状态的均匀性;wx ae玉米淀粉颗粒的偏光十字出现畸形，说明其内部结晶态与WT淀粉不同。 (3) WT玉米颗粒在扫描电镜下观察，表面比较粗糙，颗粒内部能观察到明显的脐点;ae典型煎鸡蛋状淀粉中间与外围有明显的界限，表面有blocklet结构存在;GEMS-0067玉米颗粒有的呈细长棒状，颗粒中心有脐点，颗粒断面有blocklet结构;wx ae淀粉颗粒为无规则球状，表面十分粗糙，颗粒中心有空洞，颗粒断面有blocklet结构;ae du玉米颗粒中有的能观察到片层结构和断面的blocklet结构。Blocklet结构广泛存在于不同链/支玉米的淀粉颗粒中。 (4)在原子力显微镜下，WT玉米典型球状淀粉颗粒能观察到明显的生长环和blocklet结构及其表面淀粉酶分解后的凹陷小坑点;ae玉米典型淀粉颗粒呈煎鸡蛋状，中间高，周围低，没有观察到生长环结构，却有明显的blocklet结构及其表面酶分解后的凹陷小坑点;GEMS-0067玉米典型淀粉颗粒呈细长棒状，有的能观察到生长环结构;wx ae淀粉颗粒多数呈无定形球状，中间有明显生长环;ae du玉米淀粉呈球状或煎鸡蛋状，球状颗粒有明显的生长环结构;blocklet结构和酶分解凹陷小坑点也均能在ae、GEMS-0067、wx ae和ae du玉米品种淀粉颗粒内观察到。 (5)原子力显微镜力曲线结果说明各玉米淀粉颗粒脐点附近blocklet结构排列松散，而其它区域未观察到明显规律。 (6)近红外和拉曼光谱结合主成分分析可以用于不同链/支比玉米品种的鉴别。采用近红外光谱技术对五个玉米品种一起鉴别时，WT和单基因突变品种ae玉米颗粒的聚类效果较好，而双基因突变GEMS-0067、wx ae和ae du品种由于具有共同的ae突变基因，聚类效果较差。当分别对每两个玉米品种进行主成分分析时，WT和ae，WT和wx ae，ae和wx ae相互之间有明显的聚类趋势，其它品种相互之间不能有效区分。采用拉曼光谱技术，即使五个玉米品种一起鉴别，不同粉质和蜡质部分的切块有明显的聚类趋势，不同品种之间也有明显的聚类趋势。拉曼光谱的定性分析结果比近红外光谱好，可为玉米品种的选育提供快速有效鉴别方法。 (7)红外和拉曼化学成像技术相结合可以用来分析不同链/支比玉米品种不同位置处淀粉颗粒结晶度的差异，以及单个淀粉颗粒内部结晶度的差异。WT玉米淀粉结晶度分布均匀，单个颗粒内部、不同细胞淀粉之间、不同位置均一致。ae玉米淀粉平均结晶度较WT高，但是典型ae玉米淀粉颗粒两相之间线性部分和分支部分比例相当，且结晶度分布均匀，说明ae突变基因只影响blocklet的组装或是改变其定向排列，从而使得典型ae玉米淀粉呈现两相性。与WT玉米淀粉相比，GEMS-0067玉米淀粉平均结晶度增强，说明HAM和ae基因的共同作用增加了淀粉颗粒形态的不均匀性，增强了淀粉结晶度，但并没有改变淀粉结晶度的均匀性，棒状淀粉颗粒内部结晶度仍然均匀分布。wx ae淀粉颗粒平均结晶度WT高，且颗粒内部结晶度分布均匀，说明wx和ae两个基因的相互作用，增强了淀粉颗粒的结晶度，没有改变其线性部分和分支部分的比例。ae du淀粉结晶程度为五种淀粉中最低的一种，说明du基因的引入降低了淀粉颗粒结晶度。 (8)红外化学成像技术可以用来分析不同链/支比玉米品种不同位置处淀粉吸水能力、老化能力、蛋白质含量等的差异:1）wx ae玉米淀粉吸水能力最强。WT玉米淀粉颗粒结晶状态均一，较难吸收水分。ae玉米颗粒中部和基部淀粉较WT玉米吸收水分多。GEMS-0067和ae du玉米颗粒冠部和基部的淀粉吸水能力与ae也有不同。2）WT、ae和GEMS-0067玉米淀粉老化能力相当。wx ae品种玉米淀粉不易老化。ae du玉米颗粒冠部淀粉较其它两位置处淀粉易老化。3) WT玉米蛋白质整体来说含量最低，淀粉含量最多，淀粉颗粒在WT玉米颗粒中得到了充分的积累。ae玉米品种各位置淀粉含量较WT减少，蛋白质增多。wx ae品种与其它品种比较，变化最突出，蛋白质含量最高，且冠部和中部高于基部。ae du玉米与ae相比，淀粉多，蛋白质少。GEMS-0067玉米冠部和中部位置淀粉和蛋白质相对含量与ae品种类似。 (9)红外化学成像技术结合主成分分析可以用于不同链/支比玉米品种的鉴别，且基于多个特征波段的鉴别结果较基于全波段光谱区域的好。

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摘要

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第1章 绪论

1．1 淀粉概述

1．2 淀粉组成与结构

1．2．1 直链淀粉和支链淀粉

1．2．2 水分

1．2．3 淀粉颗粒的结构

1．2．4 淀粉的生长环结构

1．2．5 淀粉的blocklet结构

1．2．6 淀粉的片层结构

1．2．7 淀粉颗粒中的孔、通道和空洞结构

1．2．8 淀粉合成

1．3 玉米淀粉的用途

1．4 基于振动光谱分析和化学成像技术的植物组织分析与鉴别研究现状

1．4．1 红外光谱技术在植物组织分析与鉴别中的研究现状

1．4．2 拉曼光谱技术在植物组织分析与鉴别中的研究现状

1．4．3 红外化学成像技术在植物组织分析与鉴别中的研究现状

1．4．4 拉曼化学成像技术在植物组织分析与鉴别中的研究现状

1．5 研究对象、目的和内容

1．5．1 研究对象

1．5．2 研究目的

1．5．3 主要研究内容

1．5．4 技术路线图

1．6 本章小结

第2章 不同链／支比玉米淀粉颗粒形态和微观结构原位表征

2．1 原位分析玉米淀粉结构的必要性

2．2 试验材料与样品制备方法

2．2．1 试验材料与试剂

2．2．2 样品制备方法

2．3 试验仪器和方法

2．3．1 主要试验仪器

2．3．2 光学显微镜(LM)

2．3．3 偏光显微镜(PLM)

2．3．4 扫描电子显微镜(SEM)

2．3．5 原子力显微镜(AFM)

2．4 结果与讨论

2．4．1 玉米切片碘染色结果

2．4．2 玉米切片胚乳淀粉颗粒偏光十字分析

2．4．3 断裂面扫描电镜扫描结果分析

2．4．4 原子力显微镜扫描结果分析

2．4．5 典型淀粉颗粒结构力曲线分析

2．5 本章小结

第3章 不同链／支比玉米颗粒近红外和拉曼光谱分析与主成分鉴别

3．1 近红外与拉曼光谱技术分析的理论基础

3．1．1 近红外光谱技术的基本原理及特点

3．1．2 拉曼光谱技术基本原理及其特点

3．1．3 光谱数据预处理方法

3．1．4 异常样品剔除方法

3．1．5 主成分分析

3．2 试验材料与样品制备方法

3．3 试验光谱仪器与数据处理软件介绍

3．3．1 Nexus智能型傅立叶交换红外光谱仪

3．3．2 LabRAM HR共聚焦拉曼显微镜

3．3．3 TQ Aanlyst软件介绍

3．4 光谱采集

3．4．1 近红外光谱采集

3．4．2 拉曼光谱采集

3．5 近红外光谱分析与主成分鉴别

3．5．1 近红外原始光谱分析

3．5．2 近红外光谱异常光谱剔除

3．5．3 主成分鉴别分析

3．6 拉曼光谱分析与主成分鉴别

3．6．1 拉曼光谱分析

3．6．2 拉曼异常光谱别除

3．6．3 主成分鉴别分析

3．7 近红外光谱和拉曼光谱鉴别结果对比分析

3．8 本章小结

第4章 不同链／支比玉米淀粉红外和拉曼化学成像分析研究

4．1 化学成像的理论基础

4．1．1 化学成像分析的原理

4．1．2 化学成像的分类

4．1．3 化学成像数据分析

4．1．4 红外显微镜的组成、成像模式及特点

4．1．5 拉曼显微镜组成、工作原理及特点

4．3 红外显微镜介绍、图像采集与数据处理软件介绍

4．3．1 Nicolet iN10 MX红外显徼镜介绍

4．3．2 红外图像采集

4．3．3 红外图像分析与数据处理软件

4．4 红外显微图像结果与讨论

4．4．1 特征光谱提取与鉴别分析

4．4．2 PCA分析

4．5 拉曼显微镜介绍、图像采集与数据处理软件介绍

4．6 拉曼显微图像结果与分析

4．5．1 954 cm-1／938 cm-1峰强比分析

4．5．2 865 cm-1／938 cm-1蜂强比分析

4．7 本章小结

第5章 结论与展望

5．1 主要研究结论

5．2 主要创新点

5．3 进一步研究展望

参考文献

个人简介