GPR124信号介导的脑血管周细胞极化及迁移机制研究

摘要

粘附G蛋白偶联受体(adhesion G protein-coupled receptors，aGPCRs)家族含有33个成员，可以分成8个组。aGPCR有独特的自我催化剪切位点(GPCR proteolysis site，GPS)，在N端有众多的结构域，在进化过程中相对保守和它们在细胞与细胞和细胞与细胞外基质粘附中发挥作用。aGPCRs可以调节细胞与细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）相互作用，在生物学过程中扮演着重要角色，包括免疫系统，生殖系统，中枢神经系统，细胞极化（cell polarity）和肿瘤发生。由此推测，aGPCR相关通路在细胞损伤修复等方面也具有潜在重要作用。因此此类蛋白相关的机制研究和靶标发现在脑血管病治疗领域也可能存在潜在的应用前景。
　　引起我们关注的是:GPR124在血管发育和血管新生过程中扮演了极其重要的角色。GPR124被报导在胚胎正常发育过程中的多种类型组织包括神经系统的血管系统表达。新近报道发现GPR124敲除小鼠死于胚胎期，主要原因是血管延伸缓慢、病理性血管丛及出血等，导致在中枢神经系统的血管发育缺陷。不同细胞类型、不同发育阶段，aGPCR可能有独特的生物学效应，本论文以人脑血管周细胞为载体，率先探索GPR124参与生长诱向、细胞迁移和血管生成等生物效应。其次，我们探索脑血管危险因素（饥饿、硝化应激等）刺激后周细胞发生的极化改变和迁移是否与GPR124的再分布相关联，其分布具有何种生物学特点。最后，我们探索周细胞GPR124进行病毒表达沉默后，细胞的极化和迁移动态规律是否发生改变。在体的脑微血管损伤条件下，周细胞GPR124是否有相应的功能？由此，本课题采用心脑血管药理学技术手段（体内外疾病模型、双光子成像技术、现代分子生物学技术等）来深入阐明脑血管损伤危险因素下GPR124关联信号的精确调控机制。
　　本课题的主要研究内容具体如下:
　　1.GPR124表达质粒的构建和鉴定
　　目的:从小鼠血管内皮细胞中将GPR124克隆构建到哺乳动物表达载体上，在细胞实验和动物实验中研究其功能。
　　方法和结果:HBVP细胞培养，TRIzol法提取细胞总RNA，RNA逆转录成cDNA，GPR124蛋白结构域预测及GPR124分子克隆和截断体构建。测序正确的全长GPR124基因构建入慢病毒pLenti-CMV-3FLAG载体，将该载体包装成慢病毒既可用于瞬时转染细胞，也可以用于在动物水平过表达GPR124基因。
　　结论:本实验克隆得到了小鼠全长GPR124基因，构建到了哺乳动物表达载体pEGFP-N1，并构建了截断体。
　　2.GPR124在脑血管周细胞的表达定位研究
　　目的:研究GPR124在周细胞的表达和定位，为开展GPR124在脑血管危险因素下参与周细胞极化、迁移等研究提供实验依据。
　　方法与结果:HBVP细胞培养结合免疫组化荧光双染、共聚焦及随机光学重建显微（stochastic optical reconstruction microscopy,STORM）观察GPR124与F-actin共定位。我们发现鬼笔环肽（细胞骨架F-actin标记物）和GPR124共染色时，发现这些清晰可见的斑点是位于细胞骨架末端粘着斑结构，进一步也被GPR124与粘着斑标记蛋白vinculin的共定位所确认。
　　结论:GPR124能与细胞骨架F-actin和粘着斑标记蛋白(vinculin)共定位，并且在伪足前部的表达量明显高于细胞其他部位，推测其可以参加细胞迁移的再粘附过程。
　　3.GPR124信号介导的脑血管周细胞极化及迁移机制研究
　　目的:GPR124在脑血管危险因素下参与周细胞极化、迁移机制研究，为防治脑血管病药物靶标发现提供实验依据。
　　方法与结果:采用饥饿与硝化应激作为刺激源来模拟脑血管损伤危险因素，我们发现无糖无血清饥饿12h和硝化应激刺激源SIN-1处理的HBVP细胞与正常培养的细胞相比细胞的椭度和面积发生了变化。此外，划痕边缘细胞受某种损伤因子刺激导致GPR124在细胞运动前端表达增多。此外，我们的机制研究发现GPR124过表慢病毒侵染HBVP细胞后72h，细胞免疫染色结果显示GPR124和极化蛋白PAR3在细胞伪足部位高表达。细胞极化过程中，PAR3分布在细胞连接的顶端部分，推测其与GPR124共同调控周细胞极性的建立及维持。进一步，shRNAGPR124转染后72h，与对照组空质粒相比，微流控模型观察到了周细胞迁移能力的下降。碳素微栓脑微血管损伤模型显示，脑缺血1周后脑微血管周细胞与ki67阳性细胞共染，三维重建所用的系列光切图像(Z-stack)结果显示GPR124与NG2阳染细胞有很好的共定位特征。
　　结论:GPR124协同PAR3复合物共同参与介导脑血管损伤危险因素周细胞的极化、迁移。此外，周细胞GPR124参与损伤局部脑微血管的血管新生，推测具有潜在的脑功能修复作用。

目录

声明

致谢

前言

摘要

缩略词表

第一部分 GPR124表达载体的构建和鉴定

前言

1．1 实验仪器和实验材料

1．1．1 细胞株

1．1．2 试剂

1．1．3 主要仪器

1．1．4 溶液配制

1．2 实验方法

1．2．1 细胞培养、冻存与复苏

1．2．2 TRIzol法提取细胞总RNA

1．2．4 GPR124同源比对

1．2．6 GPR124分子克隆和截断体构建

1．3 实验结果

1．3．2 GPR124功能结构域预测

1．3．3 全长GPR124构建

1．3．4 GPR124截断体构建

1．4 讨论

1．5 结论

第二部分 GPR124在大脑周细胞的表达定位研究

引言

2．1 实验仪器和实验材料

2．1．1 细胞株

2．1．2 试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养、冻存与复苏

2．2．2 细胞电转

2．2．3 细胞免疫荧光染色

2．2．4 高分辨荧光二抗制备

2．2．5 高分辨成像细胞样本制作

2．2．6 图像处理

2．3 实验结果

2．3．2 在周细胞中GPR124与细胞骨架F-actin末端共定位

2．3．3 随机光学重建显微(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)技术观察GPR124与F-actin共定位

2．3．4 GPR124与粘着斑标记蛋白vinculin共定位

2．3．5 在周细胞中过表达GPR124-CTF的细胞定位研究

2．4 讨论

2．5 结论

第三部分 GPR124信号介导的脑血管周细胞极化及迁移机制研究

引言

3．1 实验仪器和实验材料

3．1．1 细胞株及实验动物

3．1．2 试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 溶液配制

3．2 实验方法

3．2．1 免疫荧光染色

3．2．2 Time-lapse记录细胞运动轨迹

3．2．3 GPR124 siRNA干扰

3．2．4 慢病毒制备

3．2．5 慢病毒侵染细胞

3．2．6 小鼠脑微血管栓塞模型

3．3 实验结果

3．3．2 亚硝基阴离子供体SIN-1影响周细胞GPR124的分布

3．3．3 划痕边缘细胞受损伤因子刺激导致GPR124在细胞运动前端表达增多

3．3．4 小鼠GPR124过表达慢病毒

3．3．5 周细胞中GPR124与极化蛋白PAR3共定位

3．3．6 不同siRNA对周细胞中GPR124的干扰效率比较

3．3．7 shRNA干扰减少周细胞中GPR124的表达量

3．3．8 shRNA GPR124转染干预了周细胞的定向迁移能力

3．3．9 ME模型小鼠损伤区脑微血管周细胞中GPR124的表达量上调

3．4 讨论

3．5 结论

总结与展望

参考文献

综述

附录

作者简历和博士期间的成果