乳源酵母发酵牛乳产血管紧张素转换酶抑制肽的研究

摘要

本文以雪莲菌菌粒为来源分离乳源酵母菌株，采用培养形态、生理生化方法和分子生物学方法对酵母分离株进行了鉴定，评价了不同种的代表菌株蛋白水解活性、发酵产活性肽的潜力和益生特性，对一株具有很好产活性肽潜力的酵母菌株发酵条件进行了优化，并对其发酵乳中血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽进行了分离纯化和鉴定。
　　从不同地区来源的雪莲菌粒中，共分离到66株酵母菌株，经过形态特征、生理生化特征、26S r DNA的D1/D2区序列比对及系统发育分析，分离出属于8个不同种的酵母，包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），发酵毕赤酵母（Pichiafermentans），汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），胶红酵母（Rhodotorulamucilaginosa），涎沫假丝酵母（Candidazeylanoides），近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis），马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），单孢酿酒酵母（Kazachstania unispora）。其中K.marxianus、Ka.unispora和P.fermentans的出现频率最高，而P.fermentans，D.hansenii，C.zeylanoides，C.parapsilosis和R.mucilaginosa为首次在雪莲菌中发现。
　　菌株S.cerevisiae K11，P.fermentansK14，D.hansenii H2和K.marxianus Z17具有较好的耐酸性，胃肠转运耐受性，同时也具备良好的耐受胆盐能力;在培养条件下和非生长的静息细胞状态下，4株酵母都表现出降解胆固醇活性，其中K11的降解能力最好。4株酵母均表现出能够清除DPPH自由基和羟自由基的活性。菌株K11，K14，H2和Z17具有较好的益生特性，可作为优良的潜在益生菌株。
　　蛋白降解实验表明，R.mucilaginosa D2和K.marxianus Z17蛋白水解活性最强;S.cerevisiae K11，P.fermentans K14，D.hansenii H2，C.zeylanoides D3的蛋白水解活性适中，而C.parapsilosis D4和Ka.unispora K21蛋白水解活性较弱。菌株P.fermentans K14,R.mucilaginosa D2,C.zeylanoides D3,C.parapsilosis D4和K.marxianus Z17发酵乳多肽的ACE抑制活性较高，其中R.mucilaginosa D2，P.fermentans K14和K.marxianus Z17具有较好的发酵牛乳获得ACE抑制肽的潜力，其发酵乳多肽的IC50值在53.9-227.6μg/mL之间。菌株P.fermentans K14和K.marxianus Z17发酵多肽分子量小于3kDa组分显示了更高的DPPH自由基清除活性。各菌株发酵乳多肽的羟自由基清除率在7.3％到53.5％之间，其中P.fermentans K14发酵乳多肽小于3kDa组分的清除率最高。
　　采用响应曲面法优化了K.marxianus K17发酵牛乳产ACE抑制肽的条件。发酵温度，接种量和转速对ACE抑制活性的影响极显著，初始pH不显著。温度与接种水平以及温度与转速的相互作用对ACE抑制活性有显著影响。菌株Z17发酵牛乳产ACE抑制肽最佳发酵条件为温度32℃、初始pH6.5、接种量6％和转速189 r/min，在此条件下发酵48h，发酵乳的ACE抑制活性可达为81.23±2.69％。发酵过程蛋白水解、肽酶活性和ACE抑制活性的相关性分析表明，ACE抑制活性(％)和蛋白水解（OPA指数）呈显著正相关，蛋白水解程度（OPA指数）可作为反映发酵乳ACE抑制活性的指标。氨肽酶和羧肽酶活性与ACE抑制活性有显著的正相关性。而胞内蛋白酶活性和ACE抑制活性无显著相关性，表明ACE抑制肽的释放可能是由于细胞内肽酶的作用，生成有活性的小肽后再分泌到发酵乳中。发酵过程的实验表明，最优发酵时间在稳定期中期48h，以实现最高的ACE抑制活性。
　　采用凝胶过滤色谱、RP-HPLC对K.marxianus Z17菌株发酵乳所含ACE抑制肽进行了分离纯化，得到了两个抑制活性较好的分离峰P5和P7，IC50值分别为59.2和86.3μg/mL。采用MALDI/TOF-TOF MS/MS质谱对P5和P7的序列进行鉴定，结果显示P5和P7的序列为VLSRYP和LRFF，分别对应于κ酪蛋白第31-36位和αs1酪蛋白第21-24位氨基酸的肽段。查阅相关数据库和文献表明这两条肽为新发现的乳蛋白源ACE抑制肽。测定了VLSRYP和LRFF的ACE抑制活性，IC50值分别为36.7μmol/L和116.9μmol/L，这两条肽的抑制动力学Lineweaver-Burk图表明，它们对ACE的作用方式为竞争性抑制。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 食源蛋白生物活性肽

1．1．1 概述

1．1．2 食源生物活性肽的制备方法

1．1．3 食源生物活性肽的分离纯化

1．2 降血压肽

1．3 抗氧化肽

1．4 乳蛋白生物活性肽

1．4．1 乳蛋白活性肽的功能

1．4．2 乳蛋白活性肽酶解法制备

1．4．3 乳蛋白活性肽发酵法制备

1．5 乳源酵母

1．5．1 分布和多样性

1．5．2 乳源酵母特性及在干酪发酵中的作用

1．5．3 益生特性

1．6 本研究的立题依据与研究内容

1．6．1 立题依据

1．6．2 研究内容

第2章 雪莲菌来源酵母的分离与鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 样品与菌株

2．1．2 试剂与培养基

2．1．3 仪器设备

2．1．4 酵母的分离

2．1．5 形态特征和生理生化特征

2．1．6 分子生物学鉴定

2．2 结果与讨论

2．2．1 不同雪莲菌中的酵母菌的数量

2．2．2 酵母菌的表型特征

2．2．3 酵母菌的分子生物学鉴定

2．2．4 不同来源的雪莲茵酵母菌相分布

2．3 结论

第3章 雪莲菌酵母益生特性的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株

3．1．2 试剂与培养基

3．1．3 仪器设备

3．1．4 模拟胃液中的耐酸性

3．1．5 耐受模拟肠液实验

3．1．6 耐胆盐实验

3．1．7 降解胆固醇活性

3．1．8 抗氧化活性

3．1．9 数据统计分析

3．2 结果与分析

3．2．1 模拟胃液的耐酸性

3．2．2 模拟肠液耐受性

3．2．3 胆盐耐受性

3．2．4 降胆固醇活性

3．2．5 抗氧化活性

3．3 结论

第4章 乳源酵母发酵生物活性肽的筛选

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株

4．1．2 试剂与培养基

4．1．3 仪器设备

4．1．4 菌种活化与发酵乳多肽的制备

4．1．5 蛋白水解能力的测定

4．1．6 发酵乳多肽的超滤分级和HPLC分析

4．1．7 ACE抑制活性的测定

4．1．8 抗氧化活性的测定

4．1．9 蛋白浓度测定

4．1．10 数据统计分析

4．2 结果与讨论

4．2．1 酵母发酵曲线与蛋白水解

4．2．2 发酵乳多肽组分

4．2．3 ACE抑制活性

4．2．4 抗氧化活性

4．3 结论

第5章 K．marxianus Z17发酵牛乳产ACE抑制肽条件优化

5．1 材料与方法

5．1．1 菌株

5．1．2 试剂与培养基

5．1．3 仪器设备

5．1．4 培养方法

5．1．5 实验设计

5．1．6 ACE抑制活性的测定

5．1．7 蛋白水解和酶活测定

5．1．8 蛋白浓度测定

5．1．9 发酵曲线的测定

5．1．10 数据统计分析

5．2 结果与讨论

6．1．2 试剂

5．2．1 不同因素对菌浓和ACE抑制活性的影响

5．2．2 响应曲面法优化

5．2．3 蛋白水解、肽酶活性和ACE抑制活性的相关性

5．2．4 发酵过程变化

5．3 结论

第6章 K．marxianus Z17发酵牛乳产ACE抑制肽分离与鉴定

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．3 仪器设备

6．1．4 样品预处理

6．1．5 葡聚糖G-15凝胶色谱分离ACE抑制肽

6．1．6 半制备RP-HPLC纯化ACE抑制肽

6．1．7 MALDI／TOF-TOF MS／MS鉴定ACE抑制肽

6．1．8 ACE抑制活性的测定

6．1．9 蛋白浓度测定

6．2 结果与讨论

6．2．1 发酵乳ACE抑制肽的分离纯化

6．2．2 ACE抑制肽的MALDI／TOF-TOF MS／MS质谱鉴定

6．2．3 LRFF和VLSRYP的IC50值测定与抑制动力学性质

6．3 结论

第7章 结论与展望

7．1 全文结论

7．2 本文创新点

7．3 研究展望

参考文献

作者简介与研究成果

致谢