白菜花粉发育和授粉受精相关长链非编码RNA的鉴定方法

摘要

花粉形成和授粉受精是种子植物完成有性生殖及世代交替的重要环节，与生产上雄性不育系的利用、种子产量的高低与质量的优劣等息息相关。揭示其分子机理对于从理论上深入理解植物基本生命现象以及在实践中广泛开展杂交育种、提高种子产量和质量等均具有重要意义。
　　近年来，高通量测序技术的迅猛发展，使得人们得以从基因组水平上认识和把握以拟南芥和水稻为代表的植物生殖发育过程。长链非编码RNA（long non coding RNA，lncRNA）作为在基因组中广泛存在的一类非编码分子，已被证明是真核生物调控基因表达的重要元素，而关于其是否及在多大程度上参与了花粉发育和授粉受精等生殖发育过程，目前还鲜有报道。
　　本文在前期获得的一条与白菜花粉发育相关的lncRNA——BcMF11的基础上，试图对其进行表达和作用机制的进一步研究;同时，为了筛选更多的花粉发育和授粉受精相关lncRNA，以白菜（Brassica campestrisL.ssp.chinensis Makino，syn.Brapa ssp.chinensis）‘矮脚黄’核不育(‘Aijiaohuang' genic male sterility，ajhGMS)两用系‘Bcajh97-01A/B’不同发育阶段的花蕾及授粉后不同时间的雌蕊为材料，通过高通量转录组测序(RNA-seq)技术，在全基因组水平上鉴定潜在的白菜lncRNA并对获得的lncRNA进行了序列、在染色体上的分布、表达等特点的分析;在此基础上，比较了不育株系（‘Bcajh97-01A’）和可育株系（‘Bcajh97-01B’）Ⅰ～Ⅴ级花蕾中lncRNA的表达差异;分析了授粉受精过程中lncRNA的表达情况;同时，运用生物信息学手段，对获得的白菜lncRNA进行了是否是miRNA内源伪靶基因的模拟以及靶基因的预测及共表达分析;对白菜lncRNA与拟南芥lncRNA的相似性进行了比较和分析;以及根据靶基因的功能注释进一步挖掘了在花和花粉发育过程中起作用的候选lncRNA。取得了如下主要研究结果;
　　(1)对BcMF11基因的序列进行了克隆，发现其在白菜、甘蓝、黑芥的基因组中均存在多个同源相似序列;利用RT-PCR技术对其在白菜不同组织中的表达进行了分析，发现其并非之前研究所认为的那样在花蕾中特异表达，而是在根中偏向性表达。
　　(2)以ajhGMS‘Bcaj h97-01 A/B’不同发育阶段的花蕾及授粉后不同时间的雌蕊为材料，利用高通量转录组测序(RNA-seq)技术，在构建的Unigenes库的基础上，进一步利用生物信息学的手段，筛选鉴定出了12051条高度可信的白菜候选lncRNA。利用RT-PCR方法对筛选出的部分lncRNA的表达进行了验证，两者的结果基本一致。对这些白菜lncRNA的特点进行分析后发现，98％以上的白菜lncRNA长度在1000 bp以内，在白菜各染色体上均匀分布，尽管lncRNA的表达量均较低，但具有与组织及发育进程相关的表达特点。
　　(3)对白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’不育株系和可育株系五级花蕾（Ⅰ级花蕾对应于花粉发育的花粉母细胞时期，Ⅱ级花蕾对应于减数分裂时期，Ⅲ级花蕾对应于单核花粉期，Ⅳ级花蕾对应于二核花粉期，Ⅴ级花蕾对应于成熟花粉期）中lncRNA的表达分析及同级花蕾表达差异分析发现，在不育株系‘Bcajh97-01A’的花蕾发育过程中，Ⅳ级花蕾lncRNA的表达最多，而在Ⅴ级花蕾中特异表达的lncRNA最多;在可育株系‘Bcajh97-01B’的花蕾发育过程中，在Ⅲ级花蕾中表达的lncRNA最多，而在Ⅴ级花蕾中特异表达的lncRNA最多。综合五级花蕾的lncRNA表达情况，在可育株系花蕾中表达的lncRNA的总数比在不育株系花蕾中表达的lncRNA总数要高;在同级花蕾中，除Ⅳ级外，其余发育阶段的花蕾均表现出可育株系比不育株系具有更多的lncRNA的表达;在可育株系和不育株系的花蕾中也具有共同表达的lncRNA，其中，Ⅰ级花蕾具有最多的共表达lncRNA，共表达最少的是Ⅳ级花蕾。
　　(4)对白菜授粉后不同时间的雌蕊（授粉后1h为花粉在柱头的萌发阶段，授粉后3h为花粉管在花柱道中的生长阶段，授粉后10h为花粉管到达胚珠并受精阶段）表达的lncRNA进行分析后发现，授粉后3h，雌蕊中lncRNA的表达最多;与未授粉对照相比，授粉后1h时部分lncRNA的表达受抑制，表达数目反而减少。
　　(5)对白菜从花蕾到授粉受精整个发育过程中lncRNA的持续表达分析后发现，从花蕾形成开始到授粉后10h期间，其中约1/10的lncRNA持续表达，其余大部分为阶段性特异表达。
　　(6)利用生物信息学手段，以本实验室前期获得的、同样在ajhGMS‘ Bcajh97-01A/B’花蕾中表达的miRNA为目标，对获得的白菜lncRNA进行了是否为这些miRNA的内源伪靶基因的预测，得到15个可能作为miRNA内源伪靶基因的lncRNA。
　　(7)对白菜lncRNA的Trans类靶基因进行预测及其共表达分析，得到904个lncRNA的共6236个Trans类靶基因，其中144个lncRNA与706个靶基因存在共表达关系。
　　(8)通过分析存在共表达关系的144个lncRNA与706个靶基因的功能注释，找到18个与花和花粉发育相关的候选lncRNA。
　　(9)对白菜lncRNA与从拟南芥数据库下载的拟南芥lncRNA进行相似性比对及保守性分析后发现，其中仅约9％的白菜lncRNA与拟南芥lncRNA存在相似性，匹配长度从28bp到1657bp不等，匹配序列的相似性较高，平均达到87％。

目录

论文说明

声明

致谢

缩写词

摘要

前言

1 文献综述：植物长链非编码RNA的研究进展

1．1 植物lncRNA的种类

1．1．1 与其在基因组所处位置相关的分类

1．1．2 按其作用的分子机制进行的分类

1．2 植物lncRNA相关转录酶

1．3 植物lncRNA参与的生物学过程

1．3．1 成花转变

1．3．2 花粉发育

1．3．3 逆境胁迫

1．3．4 其它生物学过程

1．4 植物lncRNA发挥功能的分子机制

1．4．1 信号分子

1．4．2 诱饵分子

1．4．3 引导分子

1．4．4 骨架分子

1．4．5 小RNA生物合成的前体

1．5 lncRNA在近缘物种间的保守性和进化研究

1．6 lncRNA的鉴定和表达的高通量分析

1．7 展望

2 白菜lncRNA-BcMF11基因的序列和表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 植物材料

2．1．2 基因组DNA的提取

2．1．3 RNA的提取及cDNA的合成

2．1．4 同源序列的克隆和进化树构建

2．2 结果与分析

2．2．1 在白菜、甘蓝和黑芥的基因组中均存在多个BcMF11的同源相似序列

2．2．2 BcMF11同源相似序列的进化分析

2．2．3 BcMF11同源相似序列在白菜根中偏向性表达

2．2．4 在数据库中搜索BcMF11相似序列的表达数据

2．3 讨论

2．3．1 BcMF11以多拷贝或基因家族的形式存在于芸薹属基本种中

2．3．2 BcMF11及其同源序列的表达可能受环境条件的影响较大

3 白菜花粉发育和授粉受精相关lncRNA的全基因组鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 植物材料

3．1．2 植物组织RNA的提取

3．1．3 转录组测序

3．1．4 RNA-seq构建的Unigenes库里检索BcMF11及其同源相似序列

3．1．5 利用生物信息学方法进行lncRNA的筛选

3．1．6 白菜lncRNA的特点分析

3．1．7 cDNA的合成及半定量RT-PCR验证

3．2 结果与分析

3．2．1 RNA-seq和白菜lncRNA的筛选

3．2．2 在RNA-seq数据库里未检测到BcMF11及同源序列的表达

3．2．3 白菜lncRNA的长度分布

3．2．4 白菜lncRNA在染色体上的分布

3．2．5 白菜lncRNA的表达特点

3．2．6 RT-PCR验证结果

3．3 讨论

3．3．1 RNA-seq进一步验证BcMF11及同源相似序列非花蕾特异表达

3．3．2 基于普通转录组测序进行lncRNA鉴定是可行的

3．3．3 测序获得的lncRNA的可信度较高

3．3．4 白菜lncRNA的长度分布情况与其它植物类似

3．3．5 白菜各染色体均匀产生lncRNA

3．3．6 白菜lncRNA的表达具有组织及发育进程特异性

3．3．7 利用RT-PCR验证RNA-seq结果的可行性探讨

4 白菜‘Bcajh97-01A／B’不育株系和可育株系花蕾不同发育阶段lncRNA的表达及差异分析

4．1 材料与方法

4．2 结果与分析

4．2．1 不育株系花蕾不同发育阶段lncRNA的表达

4．2．2 可育株系花蕾不同发育阶段lncRNA的表达

4．2．3 不育株系和可育株系花蕾lncRNA的表达差异

4．3 讨论

5 白菜授粉受精过程lncRNA的表达分析

5．1 材料与方法

5．2 结果与分析

5．2．1 授粉后不同时间的雌蕊中lncRNA的表达

5．2．2 lncRNA在花蕾形成到授粉受精整个过程中的持续表达分析

5．3 讨论

5．3．1 花粉管在花柱道中生长时lncRNA的表达最多

5．3．2 部分lncRNA在授粉后1 h时的雌蕊中的表达受抑制

5．3．3 在花粉发育和授粉受精过程持续表达的lncRNA具有重要的挖掘意义

6 白菜lncRNA的作用机制和生物学功能预测

6．1 材料与方法

6．1．1 miRNA内源伪靶基因的预测

6．1．2 lncRNA靶基因预测及其共表达分析

6．2 结果与分析

6．2．1 可能作为miRNA内源伪靶基因其作用的lncRNA

6．2．2 作为miRNA内源伪靶基因的lncRNA的表达分析

6．2．3 部分lncRNA能预测出Trans类靶基因

6．2．4 lncRNA及其靶基因的表达协同性分析

6．2．5 从耙基因的功能注释筛选花粉发育相关的lncRNA

6．3 讨论

6．3．1 lncRNA作为miRNA内源伪靶基因起作用在植物中可能具有普遍性

6．3．2 在花粉发育过程中与靶基因协同地表达的lncRNA可能起着重要的调控作用

7 白菜lncRNA与拟南芥lncRNA相似性比对及保守性分析

7．1 材料与方法

7．2 结果与分析

7．3 讨论

结论

参考文献

附录

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