白菜花粉发育与授粉受精相关基因BcAHA8的表达分析及BcSKS11的功能鉴定

摘要

花粉发育及后续的授粉受精过程涉及复杂的基因表达调控网络。近年来，由于模式植物拟南芥基因组测序的完成，基因组数据的不断增加伴随生物信息学的迅速发展，为研究植物花粉发育及授粉受精过程相关基因表达和调控模式奠定了基础。本实验室采用ATH1芯片分析白菜（Brassica campestrisL.ssp.chinensis Markino var.communis Tsen et Lee）ajhGMS‘Bcajh97-01A/B'花蕾的基因差异表达基因时，检测到一批花粉发育和授粉受精过程特异表达的相关基因。这些基因在白菜mmc对应的野生型中上调表达，也在授粉后的雌蕊中上调表达（蒋晶晶等，未发表）。其中转录本为At3g42640的基因编码植物质膜H+-ATPase，其白菜同源基因可能作用于花粉发育及授粉受精过程。植物质膜H+-ATPase参与物质的次级跨膜转运、气孔的开闭、细胞的伸长生长以及植物对环境胁迫的响应等生理过程，被喻为植物生命活动的“主宰酶”。突变生物学研究发现编码质膜运载体的基因在花粉发育、授粉受精、环境胁迫等过程中发挥着重要作用。但目前对于编码植物质膜H+-ATPase这类运载体的基因描述相对较少，具体所执行的功能更不得而知。另一个基因BcSKS11编码的蛋白质是一个多铜氧化酶，前期的研究结果表明其在成熟花粉及授粉后的嫩角果中表达，推测其作用于花粉发育及授粉受精过程。为了描述白菜At3g42640同源基因的结构和表达特征，为进一步探究其功能打下基础,本研究利用同源扩增的方法克隆基因全长，分析其序列结构特征并预测其蛋白质结构和功能，同时采用RT-PCR或qRT-PCR方法分析其在可育株系和不育株系不同发育阶段花蕾和授粉前后雌蕊的表达情况，采用组织原位杂交进行该基因的细胞定位，分析其与花粉发育及授粉受精的关系;同时，为研究BcSKS11基因的功能，我们通过构建反义RNA表达载体，利用农杆菌介导的方法导入菜心中，对获得的KanR植株进行分子、形态和细胞学的检测，从而初步分析其功能。取得的主要结果如下:
　　 (1)利用同源扩增的方法扩增获得了At3g42640在白菜中的同源基因的cDNA全长。cDNA全长为3199 bp，其中ORF为2847bp。该基因编码该基因编码948个氨基酸，对其蛋白质的二级结构进行预测，发现该蛋白质含有41.9％的α螺旋，9.8％的β折叠和48.3％的环状结构。SMART对所推测氨基酸的功能域进行预测发现具有典型的H+-ATPase运载体的结构域Cation_ATPase_N、E1-E2_ATPase，说明这是一个典型的H+-ATPase运载体基因。该基因与拟南芥中AHA8编码的氨基酸序列比较，发现具有相同的特征，同源性高，故将其命名为Brassica campestris AHA8(BcAHA8。
　　 (2)利用半定量RT-PCR对白菜核隐性不育两用系‘Bajh97-01A/B'的不育株系的根、茎、叶、雌蕊、角果、花的表达情况进行分析，发现BcAHA8只在花中表达;对不育和可育株系Ⅰ～Ⅴ级花莆进行表达分析，只在可育系的Ⅴ级花蕾表达。进而对可育株系的花器官组织花瓣、萼片、花丝、雄蕊中BcAHA8的表达情况进行了检测，结果表明BcAHA8在雄蕊中表达量最高，萼片次之，花瓣中有微量表达;在授粉后的嫩角果中BcAHA8持续表达。利用实时定量RT-PCR对BcAHA8有表达的器官和组织进行了定量分析，结果表明授粉后的嫩角果中BcAHA8在2h时表达量最高，随后下降，在24 h时有升高的趋势。同时BcAHA8在雄蕊中表达量最高，开放花和5级花蕾次之。原位杂交技术分析了BcAHA8在可育株系Ⅰ～Ⅴ级花蕾和授粉后2h，12 h雌蕊中的表达情况，结果表明在双核和成熟花粉中检测到很强的杂交信号。在授粉后的雌蕊中，BcAHA8杂交信号在2h和12h的柱头中检测到。
　　 (3)构建了反义RNA表达载体pBI35S-BcSKS，农杆菌介导法转化菜心，获得了KanR抗性菜心植株。分子检测表明已得到了转基因芽系。

目录

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摘要

前言

1 文献综述

1．1 植物雄配子发育

1．1．1 影响花粉发育的雄配子突变体

1．1．2 影响配子体细胞分化的突变体

1．1．3 小孢子不均等分裂相关基因

1．1．4 控制雄配子发育的基因

1．1．5 花粉发育的转录组研究

1．1．6 两个全局性的雄配子基因表达方案

1．1．7 转录后调控

1．1．8 遗传学和转录组信息的整合

1．2 被子植物授粉受精

1．3 植物质膜H+-ATPase

1．3．1 植物质膜H+-ATPase的结构特征

1．3．2 植物质膜H+-ATPase的分子作用机制

1．3．3 植物质膜H+-ATPase的功能研究

1．3．4 植物质膜H+-ATPase家族成员研究

2 白菜花粉发育与授粉受精相关基因BcAHA8的克隆及序列分析

2．1 材料与方法

2．1．1 植物材料

2．1．2 基因组DNA提取

2．1．3 总RNA的提取及cDNA的合成

2．1．4 cDNA和DNA全长序列的扩增

2．1．5 基因序列分析

2．2 结果

2．2．1 目的基因cDNA全长的获得

2．2．2 目的基因DNA扩增

2．2．2 BcAHA8核苷酸及氨基酸序列分析

2．3 讨论

3 白菜‘Bcajh97-01A／B’的BcAHA8时空表达模式分析

3．1 材料与方法

3．1．1 半定量RT-PCR分析

3．1．2 qRT-PCR分析

3．1．3 原位杂交分析

3．2 结果

3．2．1 BcAHA8基因在白菜花粉发育及授粉受精中持续表达

3．2．2 BcAHA8在成熟花粉和授粉后雌蕊中特异表达

3．3 讨论

3．3．1 BcAHA8是一个花粉晚期表达基因

3．3．2 BcAHA8可能参与授粉受精过程

4 花粉发育与授粉受精相关的抗坏血酸氧化酶基因BcSKS11的功能研究

4．1 材料与方法

4．1．1 BcSKS11反义RNA载体的构建

4．1．2 反义BcSKS11表达载体对菜心的遗传转化

4．1．3 转基因植株的分子检测

4．2 结果与分析

4．2．1 BcSKS11反义RNA载体的构建

4．2．2 获得转反义BcSKS11菜心植株

4．2．3 PCR检测初步证明反义表达载体成功转入菜心植株

4．3 讨论

结论

参考文献

硕士期间发表的文章